【地方标准】 猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测 套式RT-PCR方法

ICS 11.220
B41
安徽省地方标准
DB34/T1943-2013
猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法
Method of detection and differentiation of virulent and vaccine strains of classical swine fever virus by nested RT-PCR

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场。本标准主要起草人：孙裴、李郁、魏建忠、朱良强、殷宗俊、杨勇、何长生、高亚飞、占松鹤、曾祥明、秦娟。

1 范围
本标准规定了猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）强毒株与疫苗株鉴别检测的套式RT-PCR方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测及野毒株与疫苗株的鉴别。

2 规范性引用文件
GB/T 27540 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法
中华人民共和国农业部公告第302号

3 术语和定义
3.1 强毒株
能使猪产生临床症状和死亡的猪瘟病毒株称为猪瘟病毒强毒株。

3.2 疫苗株
能够引起机体免疫应答但不引起明显临床症状的减毒猪瘟病毒株称为疫苗株。

4 试剂和材料
4.1 试剂
除另有说明外，所有试剂均为分析纯，使用无RNA酶容器分装。

4.2 TRIzol
RNA提取试剂，4℃～8℃保存，避光处理。

4.3 氯仿
4℃预冷。

4.4 异丙醇
4℃预冷。

4.5 75%乙醇
用无水乙醇与DEPC水配制，-20℃预冷。

4.6 DEPC水
去离子水加入0.1% DEPC，37℃处理1h后，高压灭菌。

4.7 RNA酶抑制剂（30U/μL）
4.8 10×PCR buffer、dNTP等PCR反应体系试剂。

4.9 引物序列
套式PCR第一步上游引物F1：5'-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3'
套式第二步上游引物F2：5'-ACCCTRTTGTARATAACACTA-3'
共用下游引物R：5'-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3'
（Y=C或T，R=A或G）

4.10 反转录酶 SuperscriptⅢ（200U/μL）
4.11 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（5U/μL）
4.12 阴性对照：DEPC水
4.13 阳性对照：中国猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）、标准Shimen强毒株

5 器材和设备
包括高速冷冻离心机、PCR仪、组织匀浆器、微量移液器、离心管等。

6 样品采集
6.1 采样注意事项
采样及样品前处理过程应佩戴一次性手套，避免交叉污染。

6.2 采样工具
扁桃体采样器、鼻钳子、开口器、采样枪等，使用前需消毒处理。

6.3 采样方法
6.3.1 活体样品
固定猪只上唇，用开口器打开口腔，使用采样枪采集扁桃体样品。