【地方标准】 鸭甲肝病毒 血清1型和3型双重RT-PCR鉴别方法

DB37/T2760-2016
鸭甲肝病毒血清1型和3型双重RT-PCR鉴别方法
Duplex RT-PCR detection method for duck hepatitis A virus type 1 and 3
发布日期：2016-05-13
实施日期：2016-06-13
发布单位：山东省质量技术监督局

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。DB37/T2760—2016
本标准由山东农业大学负责起草，山东省农科院家禽研究所、山东省畜牧兽医职业学院等参加起草。本标准主要起草人：姜世金、谢之景、宋敏训、刁有祥、李舫、张瑞华、陈君豪、陈琳琳、沈美艳。

1 范围
鸭甲肝病毒血清1型和3型双重RT-PCR鉴别方法。本标准规定了兽医实验室对两种血清型的鸭甲肝病毒（DHAV）即1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3）进行双重RT-PCR鉴别的操作规程和技术要求。本标准适用于鸭甲肝病毒血清1型和3型的快速鉴别诊断。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
NY/T 554—2002 鸭病毒性肝炎诊断技术
SN/T 3464-2012 鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范

3 实验室条件
3.1 仪器
PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移移液器和水浴锅等。
3.2 操作区域
样品操作区要有相应的生物安全设施：RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净。样品操作区、RNA提取区、PCR扩增区、电泳区应单一方向，不得倒流。电泳区与其他操作区域相互隔离。
3.3 操作者
操作者应接受过实验室生物安全培训、分子生物学实验室检测技术培训。

4 试剂的准备
4.1 试剂
4.1.1 RNA提取试剂盒。
4.1.2 一步法RT-PCR试剂盒。
4.1.3 1%琼脂糖凝胶，见A.1。
4.1.4 1X TAE缓冲液，见A.2。
4.1.5 5-溴化乙锭（10 μg/μL），见A.3。
4.1.6 核酸电泳加样缓冲液，见A.4。
4.1.7 DEPC水，见A.5。
4.1.8 DNA分子量标准参照物，要求在100 bp~1000 bp之间有5条以上的指示条带。
4.1.9 用已知的含有与RT-PCR检测引物（附录B）相对应的且灭活的1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒制作的阳性对照标准品。
4.1.10 用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。
4.2 引物
序列见附录B，浓度均为10 μmol/L。

5 操作程序
5.1 样品的采集和处理
对临床发病怀疑感染鸭病毒性肝炎的病例无菌采集鸭肝脏样品，于-20℃保存。
5.2 设置对照
每次检测时，使用阳性对照标准品和阴性样品对照品，至少设置一个或一个以上的阳性对照和阴性对照。
5.3 RNA提取
参照RNA提取试剂盒的说明书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随即进行检测，否则应于-70℃冻存。
5.4 RNA扩增体系的配制
按照一步法RT-PCR试剂盒说明书要求，配制RT-PCR反应体系。总反应体系为50 μL，其中DEPC水12.6 μL，2×RT-PCR缓冲液25 μL，RT-PCR酶混合物2 μL，引物DHAV-1F和DHAV-1R（10 μmol/L）各1.2 μL，引物DHAV-3F和DHAV-3R（10 μmol/L）各1.0 μL，待检样品RNA 6 μL。
如果同时进行多个样品的检测，可以按照上述比例，将待检的RNA以外的溶液混合在一起，然后每个RT-PCR管中分别加入44 μL此混合液，再加入6 μL对应样品的RNA。
5.5 RT-PCR反应
按照一步法RT-PCR试剂盒操作说明，设置反应条件。第一步是RT，AMV反转录酶最适反应温度是42℃，M-MLV反转录酶最适反应温度是37℃，反转录时间是30 min；第二步是灭活反转录酶，95℃、3 min；第三步是PCR，PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 50 s，60℃ 50 s，72℃ 40 s，循环30次；最后一步 72℃ 10 min。
5.6 RT-PCR产物电泳
RT-PCR结束后，每个RT-PCR管加入5 μL核酸电泳加样缓冲液，密闭RT-PCR管，成分混合，然后每管取5 μL~10 μL加入1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，在位于凝胶中央的加样孔中加入DNA分子量标准参照物。加样后，按照每厘米凝胶 5V 电压，电泳 20 min~40 min。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察，根据DNA分子量标准参照物判断RT-PCR扩增产物的大小。

6 结果判定
阳性对照出现相应大小的目的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，不能进行判断。按照如下条件进行判定：
— 从样品中只扩增出了492 bp的产物，则该样品为DHAV-1阳性，DHAV-3阴性。
— 从样品中只扩增出了286 bp的产物，则该样品为DHAV-3阳性，DHAV-1阴性。
— 从样品中同时扩增出了286 bp和492 bp的产物，则该样品为DHAV-1和DHAV-3亚型共存在，二者均为阳性。
— 从样品中未扩增出286 bp和492 bp的产物，则该样品不含有DHAV-1和DHAV-3，二者均为阴性。