【地方标准】 副猪嗜血杆菌病诊断技术

副猪嗜血杆菌病诊断技术DB32/T1772—2011副猪嗜血杆菌病诊断技术本标准规定了副猪嗜血杆菌病的诊断技术要求，适用于猪群中副猪嗜血杆菌感染的诊断。2011-05-06发布，2011-07-06实施，江苏省质量技术监督局发布前言为规范副猪嗜血杆菌病的诊断技术，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编制。本标准由江苏省农业科学院提出，起草单位为江苏省农业科学院，主要起草人包括刘茂军、邵国青、周勇岐、王海燕、冯志新、孙佩元和甘源。1 范围副猪嗜血杆菌病诊断技术本标准规定了副猪嗜血杆菌病诊断技术要求。本标准规定的分离鉴定和PCR法适用于本病的确诊，间接血凝试验适用于大批量样品的普查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程，GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法，NY/T541动物疫病实验室检验采样方法。3 术语和定义3.1副猪嗜血杆菌病副猪嗜血杆菌病，又称格拉泽氏病或革拉泽氏病（Glasser's disease），由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPs）引起，可以影响各年龄段的猪，尤其是在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，表现为纤维性多发性浆膜炎、关节炎、胸膜炎和脑膜炎等。4 诊断4.1 流行性病学诊断副猪嗜血杆菌只感染猪，感染2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%。在敏感猪群内，副猪嗜血杆菌引起的死亡主要发生在幼猪。4.2 临床诊断由副猪嗜血杆菌引起的急性型疾病是非特异性的，但却是特征性的，临床症状包括发热、食欲不振、厌食，严重时可见呼吸困难、发热、不愿活动、关节肿胀、跛行、运动不协调以及死亡。急性发病耐过猪可以痊愈，但病症严重，猪耐过后往往表现慢性病症，主要表现为被毛粗乱、咳嗽、呼吸困难和生长迟滞。有些猪因发生脑膜炎而表现肌肉震颤、麻痹和惊厥，有些则因腹膜粘连而常引起肠梗阻。4.3 病理变化肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物，这些浆膜包括腹膜、心包膜和胸膜，损伤也可能涉及脑膜和关节表面，尤其是腕关节和关节。胸腹腔积液或粘连，关节肿胀、关节腔粘液增多，肺脏出血、表面有纤维素性渗出物附着，全身淋巴结水肿、出血。在显微镜下观察渗出物，可见纤维蛋白、中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。病死猪及病料应符合按GB16548的规定。5 病原学诊断5.1 病原分离与鉴定除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的灭菌二级水。5.1.1 材料准备巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板、TSA固体培养基、TSB液体培养基、副猪嗜血杆菌标准菌株、细菌微量生化鉴定管、灭菌棉子等。5.1.2 病料采集按NY/T541规定的方法，采集呼吸道分泌物，采取具有特征的肺脏、肝脏、脾脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液和脑组织。5.1.3 病原分离采集样品，首先在巧克力琼脂平板、TSA固体培养基、鲜血琼脂平板上分别划线接种，37℃培养48h～72h后挑取单个菌落，再进行纯培养并鉴定。细菌涂片，革兰氏染色镜检。如果为革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，再进行一次巧克力琼脂亚克降培养，同时接种鲜血琼脂平板和普通琼脂平板。巧克力琼脂平板生长良好，而鲜血琼脂平板和普通琼脂平板没有菌落生成，则菌株保存待进一步鉴定。5.1.4 病原鉴定5.1.4.1 生长特性试验挑取被检分离株和副猪嗜血杆菌标准株菌落接种绵羊鲜血琼脂平板和2%陈琼脂平板上，再以金黄色葡萄球菌点种或垂直划线，置37℃培养48h。观察葡萄球菌菌落周围菌落生成情况，如愈靠近金黄色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈远的愈小，甚至不见菌落生长，且不出现溶血现象，判为阳性。5.1.4.2 生化实验培养物接种于添加有NAD的脲酶、氧化酶、吲哚、接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还原酶等细菌微量生化鉴定管，置37℃培养48h。按细菌微量生化鉴定管说明书判定。脲酶试验、氧化酶试验、吲哚试验均阴性，并接触酶、葡萄糖、麦芽糖试验为阴性，确认副猪嗜血杆菌的存在。