【地方标准】 青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范

DB63/T2291—2024 青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范
ICS65.020.20
2024-6-19 发布
2024-7-25 实施
发布机构：青海省市场监督管理局

前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青海省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务中心、青海省乡村产业发展指导中心。本文件主要起草人：徐金青、沈裕虎、王蕾、王寒冬、边海燕、韩文婷、陈同睿、王焕强、薛明珍、包天忠、李俊仁、李春桥、王健斌、赵璨、尤恩、邓超。本文件由青海省农业农村厅监督实施。

1 范围
本文件规定了青稞（Hordeum vulgare var. nudum Hook. f.）育成品种DNA指纹图谱采集的术语和定义、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、操作步骤、育成品种DNA指纹图谱和品种鉴别等技术要求。本文件适用于青稞育成品种DNA指纹图谱的采集，并对照鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 3543.2 农作物种子检验规程扦样
GB/T 3543.4 农作物种子检验规程发芽试验
GB/T 4404.1 粮食作物种子第1部分：禾谷类
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法
GB/T 30988 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法
GB/T 34265 Sanger法测序技术指南

3 术语和定义
3.1 SNP标记：基于单核苷酸多态性的分子标记
3.2 DNA指纹图谱：通过DNA检测技术，获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹。

4 缩略语
DNA：脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleic Acid）
SNP：单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）

5 仪器设备及试剂
见附录A。超纯水符合GB/T 6682的要求，所用试剂为分析纯。

6 溶液配制
见附录B。

7 引物信息
见附录C。

8 操作步骤
8.1 样品准备
8.1.1 扦样
种子质量应符合GB/T 4404.1的要求。按照GB/T 3543.2的规定，各待检品种分别进行扦样、分样；每品种籽粒分为3份，一份用于检测，一份留作复检，另一份用于备份。
8.1.2 发芽
按照GB/T 3543.4的规定进行发芽，发芽的籽粒数需大于等于50粒。
8.1.3 叶片采集
随机选取每株3片叶，共10株，采取叶片混样进行样品制备。
8.2 DNA样品制备
8.2.1 DNA提取
按照GB/T 19495.3的方法或采用商用的试剂盒进行DNA的提取。
8.2.2 DNA质量检测
8.3 PCR扩增
8.3.1 反应体系
将附录C中引物稀释至10μmol/L，DNA浓度稀释至100ng/μl~200ng/μl。反应体系为25μl，包含10x PCR反应缓冲液2μl，2.5mmol/L dNTP溶液1.6μl，10μmol/L 正向引物0.5μl，10μmol/L 反向引物0.5μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，超纯水18.2μl，样品DNA2μl。
8.3.2 反应程序
94℃预变性4min；95℃变性30s，不同引物按照附录C设置退火温度，退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
8.4 扩增产物检测和测序
按照GB/T 30988中的琼脂糖凝胶电泳法进行电泳检测，按照GB/T 34265中的方法进行测序，获得扩增产物的相应序列。

9 育成品种DNA指纹图谱
按照附录C中SNP染色体的位置，记录扩增产物的序列信息，得到青稞育成品种的DNA指纹图谱，参见附录D。

10 品种鉴别
参照附录D中青稞育成品种的DNA图谱，判断所鉴定的品种是否为相同或不同的品种。