【地方标准】 动物疫病鉴别检测技术 第2部分：兔出血症病毒经典 型与兔出血症病毒2型

DB37/T4754.2—2024
动物疫病鉴别检测技术 第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型
Animal disease identification and detection technology Part 2: RHDV and RHDV2

发布日期：2024-12-30
实施日期：2025-01-30
发布单位：山东省市场监督管理局
起草/组织实施：山东省畜牧兽医局
归口单位：山东省畜牧业标准化技术委员会

前言
DB37/T4754.2—2024
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件是DB37/T4754《动物疫病鉴别检测技术》的第2部分。DB37/T4754已经发布了以下部分：第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒；第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型；第3部分：禽腺病毒I群与禽腺病毒Ⅲ群。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

引言
DB37/T4754.2—2024
动物疫病是影响山东省畜牧业健康发展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的临床病症具有一定程度的相似性，同时，有些疫病弱毒疫苗的使用干扰了病原的检测。动物疫病鉴别检测技术标准的建立，规定了对不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鉴别检测，为山东省动物疫病精准防控提供了技术支持，对于促进畜牧业健康发展具有重要意义。
兔出血症（Rabbit haemorrhagic disease, RHD）是由杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）成员兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus, RHDv）引起的一种急性、强传染性、病死率高达40%~90%的传染病，其典型病变包括呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血等，我国将其列为二类动物疫病（中华人民共和国农业农村部公告第573号），严重威胁着我国养兔业的健康发展。
1984年，由RHDV经典型引起的RHD首先在我国暴发，继而在各大洲广泛流行，并不断发生遗传演变，但抗原性保持相对稳定。2010年，由RHDV2型引发的兔出血症首先在法国暴发，不仅导致育肥兔大量死亡，且以RHDV经典型株制备的灭活疫苗无法提供完全免疫保护，可见其抗原性发生较大变异。之后RHDV2型在欧洲、非洲、大洋洲部分国家开始流行，在瑞典、葡萄滑利、澳大利亚等国，RHDV2型已经取代RHDV经典型成为主要流行毒株。我国于2020年5月在四川省确诊了由RHDV2型引发的疫病，作为世界养兔大国，若该变异毒株发生大规模流行，势必加大防控难度。因此，建立一种可鉴别RHDV经典型与RHDV2型的检测技术对于该病的防控具有重要意义。
《动物疫病鉴别检测技术》拟由三个部分构成：
第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。目的在于规范猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒SYBR Green I型 RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在猪瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫、猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用。
第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型。目的在于规范兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型实时荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在兔出血症临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用。
第3部分：禽腺病毒I群与禽腺病毒Ⅲ群。目的在于规范禽腺病毒I群与Ⅲ群PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在禽腺病毒病临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用。

1 范围
本文件描述了兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus, RHDV）经典型与兔出血症病毒2型（Rabbit haemorrhagic disease virus 2, RHDV2）实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）鉴别检测方法。
本文件适用于兔及其产品中RHDV经典型与RHDV2型的鉴别检测。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 试验原理
在游离状态下，SYBR Green I染料只发出微弱的荧光，与双链DNA结合后荧光信号大幅度增强。在PCR反应过程中，SYBR Green I染料与扩增的双链DNA产物结合后发出荧光，且伴随扩增产物的指数型上升，荧光强度也随之上升并被荧光检测从而获得荧光扩增曲线，之后进行扩增产物熔解温度（Tm）曲线分析。由于扩增产物GC含量差异导致Tm值不同，本文件引物可通用检测RHDV经典型与RHDV2型靶基因，但由于RHDV经典型扩增产物GC含量高于RHDV2型扩增产物，导致Tm值明显高于后者，并依此适用于RHDV经典型与RHDV2型的鉴别检测。

5 试剂或材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯。
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2 TRIzol试剂。
5.3 氯仿。
5.4 异丙醇。
5.5 反转录酶M-MuLV及5×反转录酶反应缓冲液：反转录酶浓度200 U/μL，-20℃保存。
5.6 RNA酶抑制剂：50 U/μL，-20℃保存。
5.7 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）：为dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合物，均为10 mmol/L。
5.8 2X SYBR Green I PCR Mix：-20℃保存。
5.9 75%乙醇：取无水乙醇75mL，加灭菌水至100mL，混匀，室温保存。
5.10 DEPC水：取1mL DEPC加入水中至1000mL，充分震荡混匀，静置24h后，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。
5.11 磷酸盐缓冲溶液（PBS）：取NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，依次溶于800mL水中，用盐酸调pH值至7.4，定容至1000mL，置于高压灭菌锅121℃灭菌20min，4℃保存。
5.12 乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝剂：取EDTA-K2·2H2O 1.5g，溶于80mL水中，充分溶解后定容至100mL，置于高压灭菌锅121℃灭菌20min，室温保存。
5.13 一次性无菌注射器（2.5mL）。
5.14 无核酸酶离心管（1.5mL）。
5.15 商品化病毒核酸提取试剂盒。
5.16 阳性对照样品和阴性对照样品：
RHDV经典型阳性对照样品为RHDVAV34株（购自中国兽医药品监察所）肝组织毒，-20℃保存；
RHDV2型阳性样品为VP60基因体外转录的无感染性RNA，-80℃保存；
阴性对照样品为RHDV经典型、RHDV2型阴性的兔肝组织悬液，-20℃保存。
5.17 检测RHDV经典型与RHDV2型的通用引物：
Primer-F: 5'-CAACCGGACTGTTTGTGATGGC-3'
Primer-R: 5'-ACGCGAACATGATGGGTGTGTT-3'

6 仪器设备
6.1 II级生物安全柜。
6.2 电子天平：精度0.01g。
6.3 高速冷冻离心机：转速≥12000 r/min。
6.4 微型低速离心机：转速<5000 r/min。
6.5 冰箱：-20℃。
6.6 超低温冰箱：-80℃。
6.7 高压灭菌锅。
6.8 荧光PCR检测仪。

7 样品
7.1 肝组织样品
病死兔的病变肝组织样品采集、保存和运输按照NY/T 541执行。
7.2 血液样品
活兔血液样品采集：将活兔固定，选择耳缘静脉清晰的一侧耳朵，剃毛并消毒，压迫耳根使静脉充盈，用一次性无菌注射器（2.5mL）针头穿刺静脉采血1.8mL，并将新鲜血液与乙二胺四乙酸二钾抗凝剂混合，体积比为9：1 (V:V)。血液样品保存和运输按照NY/T 541执行。