【地方标准】 高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法

DB65/T 3899—2016 高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法 (RT-PCR detection method for highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus)
新疆维吾尔自治区地方标准
发布日期：2016-06-10
实施日期：2016-08-01
发布单位：新疆维吾尔自治区质量技术监督局

**前言**
本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。
本标准由乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心提出，新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。
本标准起草单位：乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、重庆市动物疫病预防控制中心。
本标准起草人：杨小亮、李建玲、李爱巧、王璐、吴星星、王涛、杨启元、张婕、陈彪、曾政、何生、施远翔、王爱菊、韩义忠。

**1 范围**
本标准规定了高致病性猪蓝耳病病毒核酸RT-PCR检测的试剂、仪器设备、操作程序及结果判定的要求。
本标准适用于猪只感染高致病性和美洲型经典猪蓝耳病病毒的检测。

**2 规范性引用文件**
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
农业部《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》

**3 术语和定义**
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 高致病性猪蓝耳病 (highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)：由猪蓝耳病病毒 (PRRSV) 变异株引起的一种猪的感染和（或）疾病综合症。以猪发烧、厌食或不食、眼结膜发炎、咳嗽、喘等呼吸道症状，后驱无力、不能站立或摇摆、抽搐等神经症状为主要临床特征的猪传染病。也被称为猪“高热病”。
3.2 逆转录-聚合酶链式反应 (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)：将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

**4 缩略语**
下列缩略语适用于本文件：
bp：base pair，碱基对；
DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸；
dNTPs：Deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核糖核苷酸；
PCR：Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应；
RT-PCR：Reverse transcription PCR，反转录PCR；
Taq酶：Taq DNA Polymerase，Taq DNA聚合酶；
DEPC：Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯；
EB：Ethidium bromide，溴化乙锭。

**5 试剂**
5.1 变性液：见附录A.1。
5.2 2 mol/L 醋酸钠溶液 (pH 4.0)：见附录A.2。
5.3 水饱和酚 (pH 4.0)。
5.4 氯仿-异戊醇 (49:1) 混合溶液。
5.5 反转录酶 (200 U/μL)。
5.6 Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)。
5.7 1.5% 琼脂糖凝胶：见附录A.3。
5.8 50x TAE 缓冲液：见附录A.4。
5.9 EB溶液 (10 μg/μL)：见附录A.5。
5.10 加样缓冲液：见附录A.6。
5.11 DEPC处理的灭菌双蒸水：见附录A.7。
5.12 异丙醇。
5.13 DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.8。
5.14 2.5 mM dNTPs。
5.15 5× PCR缓冲液。
5.16 25 mol/L MgSO4。
5.17 DNA分子量标准：DL2000 DNA Marker、DL1000 DNA Marker均可。
5.18 引物：见附录A.9。
实验用水均为蒸留水，规格符合GB/T 6682-2008的相关规定。

**6 仪器设备**
高速冷冻离心机（最高转速应大于12700 rpm）、组织研磨器或研钵、PCR扩增仪、核酸电泳仪、水平电泳槽、恒温水浴锅、2℃～8℃冰箱和-20℃冰箱、微量移液器（0.5 μL～10 μL，2 μL、20 μL，20 μL~200 μL；100 μL～1000 μL）、凝胶成像系统（或紫外凝胶成像仪）、超净工作台或通风橱、生物安全柜。

**7 操作程序**
7.1 样品的采集和处理
选择临床症状明显的病死猪3头～5头，无菌采集肺...