【地方标准】 桑蚕微粒子病诊断技术规程

桑蚕微粒子病诊断技术规程 本标准根据GB/T1.1-2009的规则起草，由四川省农业厅提出并归口，四川省质量技术监督局发布，并于2011年3月1日实施。本标准由四川省蚕业管理总站和四川省农业科学院生物技术核技术研究所等单位起草，主要起草人包括吴钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清和马露芸。 1. 范围 本标准规定了四川省桑蚕微粒子病的诊断技术要求，适用于四川省的桑蚕微粒子病诊断。 2. 规范性引用文件 本文件所引用的文件包括：GB/T6682、GB/T20395、DB51/T844等。所有引用文件的最新版本均适用于本标准。 3. 诊断方法 3.1 浓盐酸 [w(HCl)=30%] 3.2 氢氧化钾溶液 [w(KOH)=2%] 3.3 过氧化氢溶液 [w(H2O2)=10%] 3.4 分析用水按GB/T6682规定执行。 4. 仪器、设备 4.1 普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数15×40倍或16×40倍；生化培养箱（温控范围10℃~50℃）；冰箱；天平（感量：0.1g）；离心机。 4.2 离心管、无纺布滤纸；载玻片、盖玻片、测微尺；容量瓶、量筒、烧杯、二重皿；乳钵、乳棒；解剖剪、镊子、橡皮吸管；样品袋、冻存管（1.8mL、5mL）。 5. 诊断 5.1 肉眼诊断 通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状： 小蚕期：收蚁后不疏毛、体色深暗、体躯瘦小、发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐。 大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色，体壁出现微细不规则黑褐色病斑，主要分布于尾角末端、气门周围和胸腹足外侧部位；蜕皮困难，严重时死亡；群体发育不齐。 蛹蛾期：蛹表皮无光泽、反应迟钝、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑，感病严重的蛾羽化不良，鳞毛脱落，腹部大，节间松弛，交配能力差，产卵少。 卵期：卵形不正，排列不齐，卵多重叠，易脱落；不受精卵和死卵增多；催青期发育不整齐。 5.1.2 解剖观察 将外观观察中具有典型病症的大蚕期病蚕，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白色脓疱状斑块。 5.1.3 判定 通过外观观察，如果蚕的不同发育阶段出现5.1.1所述症状之一，则可疑似为蚕微粒子病；通过解剖观察，大蚕期病蚕丝腺出现乳白色脓疱状斑块时，可确诊为蚕微粒子病。 5.2 显微镜诊断 5.2.1 样品采集 采集5.1.1描述的典型症状蚕、蛹、蛾、卵样品，并置于样品袋或冻存管中，做好记录。 5.2.2 样品处置 5.2.2.1 样品保存 采集的样品每份混合均匀后再分成两份，其中一份作为检样，按5.2.2.2制备检验，另一份作为备样，保存于0℃~4℃冰箱中，保存期为30天至60天。 5.2.2.2 样本制备 不同发育时期的样品按以下方法制样： 小蚕期、大蚕期、蛹期、蛾期样品放置于生化培养箱中，温度29℃±0.5℃，相对湿度≥85%，放置2~5天。 卵期样品解除滞育后，放入生化培养箱中，温度29℃±0.5℃，相对湿度≥85%，催青至孵化后自然死亡。 5.2.2.2.2 将制备的样本放入乳钵中，用乳棒研磨，并滴加氢氧化钾溶液（[w(KOH)=2%]），再次研细。 5.2.2.2.3 用乳棒将研磨液点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样本。 5.2.3 显微镜检查 5.2.3.1 直接观察法 将镜检样本置于显微镜下观察，每个样本观察不少于20个视野，检查有无微粒子孢子。 5.2.3.2 离心沉淀法 将磨碎液用无纺布滤纸过滤，移入离心管中，进行3000r/min离心3分钟，倾去上清液，沉淀物振荡后制成镜检样本，置于显微镜下观察，每个样本观察不少于20个视野，检查有无微粒子孢子。 5.2.3.3 酸溶解法 将检出有微粒子孢子的样品进行酸溶解处理，随后继续检查。