【地方标准】 鸭3型腺病毒病诊断技术

鸭3型腺病毒病诊断技术DB35/T1872-2019标准发布于2019年12月19日，实施日期为2020年3月19日。本标准由福建省农业科学院提出，并由福建省农业农村厅归口。标准起草单位包括福建省农业科学院畜牧兽医研究所和福建省动物疫病预防控制中心，主要起草人包括万春和、黄瑜、傅光华、李中华、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈翠腾、陈红梅、傅秋玲、陈珍、朱春华。 1 范围 本标准规定了鸭3型腺病毒病的临床诊断、PCR诊断和结果判定，适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和流行病学调查。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DAdV-3：鸭3型腺病毒（Duck Adenovirus 3） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline） Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trihydroxymethyl Aminomethane） 3 疫病概述 根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses）的最新分类，腺病毒科（Adenoviridae）下设5个属，分别为富AT腺病毒属（Atadenovirus）、禽腺病毒属（Aviadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和睡液酸酶腺病毒属（Siadenovirus）。鸭3型腺病毒病主要发生于40日龄以内的鸭，临床表现为肝脏肿大、出血，脾脏肿大，胆囊肿大，肾脏肿大、出血。流行病学调查表明，该病发病率为20%～50%，病死率为60%～70%。 4 临床诊断 4.1 剖检病变 当鸭出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 肝脏肿大，表面呈点状或斑状出血； b) 脾脏肿大； c) 胆囊肿大； d) 肾脏肿大，表面出血。 4.2 初步诊断 当鸭出现4.1中检病变之一时，可做出初步诊断；确诊需进行实验室诊断。 5 PCR诊断 5.1 主要仪器设备 主要仪器设备如下： a) PCR仪； b) 高速台式冷冻离心机； c) 微量移液器； d) 组织匀浆器； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像系统。 5.2 主要试剂如下： a) 10% 十二烷基硫酸钠（配置方法按照附录A中A.1的规定）； b) 蛋白酶K（10mg/mL）（配置方法按照附录A中A.2的规定）； c) 异丙醇； d) Tris·饱和酚； e) 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）； f) 乙酸钠（3mol/L，pH5.4）； g) 无水乙醇； h) 75% 乙醇（配置方法按照附录A中A.3的规定）； i) 核糖核酸酶（20mg/mL）； j) 灭菌双蒸水； k) PBS（0.01M）。 5.3 引物 根据DAdV-3的Fiber2基因设计特异性引物，序列如下： 上游引物DAdV-3F：5'-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3'； 下游引物DAdV-3R：5'-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3'。 预期目的片段大小为548bp。 5.4 核酸DNA提取 5.4.1 酚氯仿法提取核酸DNA 5.4.1.1 取2g组织（肝脏、脾脏、肾脏或三者混合物），加入6mL PBS（0.01M）进行研磨处理，反复冻融3次，4000r/min离心15分钟，小心吸取上层水相作为组织匀浆液。 5.4.1.2 取420μL组织匀浆液和30μL核糖核酸酶加入1.5mL灭菌离心管混匀后，室温作用20分钟。 5.4.1.3 加入40μL 10%的十二烷基磺酸钠溶液和10μL蛋白酶K溶液，56℃水浴2小时。 5.4.1.4 加入等量的Tris·饱和酚，颠倒充分混匀，12000r/min离心5分钟，小心吸取上层水相于另一个离心管中。