【商检行业标准(SN)】 传染性胰脏坏死病毒(IPNV)酶链钢疫吸附试验(ELISA)诊断方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SV/T1162---2002
传染性胰脏坏死病毒（IPNV）
酶链免疫吸附试验（ELISA）诊断方法Test method of enzyme-linked immunosorhent assay(El.iSA)for infectious puncreatic necrosis virus(IPNv)2002-11-25 发布
华人民共御
国家质量鉴督检验检度旗局
2003-05-01实施
SN/ 1162—2002
本标准是在数考函际上道用的趋测规程和总站我国在法一领战的实践经验的基础一制是的，作为对1%56每发布的（E/T15805.1—05淡水类检按方法第一部分*的一个补充。整于日前ELISA快速空测技术已经成熟只有灵敏、准确、快速的代点，制定此标证有极强的实月性，已有的国家标准能起到一个补充作用。本标准的阴录A品资料性降录。
左标准由国案认证认可监费州乘委员会提出并问口。交标准起草单位：中华人民和国深圳出人境检控疫局。标准主要起草人：汀含杯、刘获、高隆英，史旁杰本标推系营次发布的捡验检变行业标准，1范围
传染性胰脏坏死病毒（IPNV）
酶链免疫吸附试验(ELISA)诊断方法本标理规定了用降低免度吐附就整检制IPN病示的本造。SN/1' 1162--2002
本标确适用1N病孕的分离及病毒抗原的整定，改本病的流行病学调查，诊断、检按和监测，2规宣悦引用文件
下列文件4的条款通过木标谨配引用所成为去标准均条效。凡是注日相的引用文件，其赋后所付的懿改单（.不包活划误的内奔)或参订版均不适用于本标准，热而，鼓励根拥本标准认求协议的务方研究是替可使而这些文件的放新版本：凡是不注口势的引用文件，其最新权本适用十本标准。GB/T6682—1992分析实验用水现格和试检方达（euV19O3696:1997）GR1F88-2000出人境动物检疮采样3试报和树判
应合(/T6821992中二级水的舰格。3.2IFN.5P肩毒
3.3限性对照
正常组内组织尽液（白备）
3.41PM-5P病毒标准抗血清
3.5酶标羊抗免IgG
器材和设备免费标准bzxz.net
4. 19G 孔细胞培睾板。
4.2酶板板：
4.3降标创定仪。
4. 4 激量存波睾等,
45显微链
4. 6面盗坪养箱
4.1普询比第众低温深箱。
1. 8 组纠研培器。
3离心机到离心普
5[PN病迷的分离
5.1只样
对临定状的宣，本长小于等于，的鱼市取整条，体长4m的鱼苗取内脏（包肾；SN/T1162—2002
体长大于。cT的急则收师、肾，脾。对无疑状的鱼取肝，肾、单成熟鱼还陷收期第液：按CB18088一20-00双荐
5.2样品处理
应在10C以下进行。带组职研磨器将样品勾浆。其用培养液（见附录A.)按1110的啦终稀秤度甚浮：在匀驼前未用拉菌表处现过的样品，则刻将样品勾浆后再悬浮于含有抗菌素的培靠液中，于1下照2h~4h或4心下解5h~245。心(/min离心15mi收第上清获。单减不些勺浆积释2倍以上。用扣同的方法离心卵巢获样品并在以尽的步累中直接用其上清减。5.3病毒分离
对上逆11℃的组织与装上清获再作两次10倍需系然后将这110、1：100和1:10=种稻释度的上消液，以适当体积分别接种到生长纳241的RTG-2,CHSE或者PG新鲜细胞单层中，邮2的跑单层最多按种1MμL稀再液，15℃～2G吸对1后训人组跑培葬液，受于℃！2G培养，
正性对脏组利特测推品都接种细胞后、7d内每大用40倍~103倍侧胃是微镜检奇.如果接了效检物勾紫上消筛液的细跑地养中出现细监病变(PE)应立即进行鉴是。如果除所性对照细脂外，没有C变白现，则在培靠了后还要用教感跑进行再传代培，传代时，冻型并收案接种了经职勾浆上游筛释获的细跑单层养物。7000r/min.4C高心15nin，收集上清该.接科划新鲜绚跑单层，培养?d每天用节创1叫倍例留微说检查.如更在阳注对照组也未出现PE，则必乘来用做感细胞和一非新的纽织祥品重新进行另一系克的病毒学检查。
6IPN病囊的鉴定
6.1包核羊抗IPN病毒抗体
等羊扩护IFN病幸的IgG用包被稀释变附录A.3)偿释成.工作依度后包满薛标板，孔0.1mL。1T据12--24h或者37反应1.5h~2h。出孔内批体。6.2洗激
游见附求加人小孔，2历后倒出，拍十：如量爱3次，6.3加入待测样品
每个样品2孔，每孔.1L。另格标准1P病米<附证对黑）正带组织样品（朗性刘照》和圳随培波（空白对斯也划2应1.h~2。阅启升内体，珠达诺向.2G.4加入免抗PN也活
每化证0.1ml.需释到工作变的免抗IFN病再血消（用细胞培弃获希释）.27及应7.5h~2h。倒出孔内报体。用PT洗2次方法同6.3，6.5消除非待异性过鼠化酶
每孔.1mLC.1火的双索水（HH,0，释）。37这应15mim以除挖非钱异性的过氧化物酶出礼内液体。用PBST送次，方法同6.2，6.6入酶标羊抗兔【g5站合物（酶标二扰）每予加人0.1m1.稀释到作波度的密标羊抗免gG(月细跑培养策稀杯）.37C反声1.l~2。倒出孔内触依，用FBST统3次方达同司.2.6.了加底物(）溶液见附录4-5)
人！尝升P落箍，室湿下谢光反应显色）：6.8加铸止液
当阅性对照出现明显栋黄色，性对照无色，文即孔加入）效度为2酸然止这，
跖果判定
s/71162—2002
样品经过接种细胞和方传后均没有CPE出现.则结总判为性，有CFI:出现.则要用ET.ISA方法进行些定是否由沪N病奇引起，
当到.1SA反应结束并加人路止滤后10min内用酶标仪测盈各孔在4JUm被长时的光吸收值（A值）。以空自对照的人假为零点。先算阳性对服和的性对因的A其之比，用性对照孔的A值（P)与期性对照孔的As值(N)之比大于2.1(即F/V证2.1>，表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的A值之比，当样品孔的A（P）与朗性对版孔的A（V)之比大十或等2.1（即F/N2.1时,定为IFNV性。
SN/T11622002
A.1养液1
(资料性附录）
拭剂配制
1别培养基：加人10的哈牛准流;抛游院虚，一0℃保件，k.2.t moi/ PspH.?--7. M
罐酸包二钠(NaHPO.)
薇腔二(NaHUO）
家化销(NaCl)
分就游部后·保存
4.3包盘稀释滤pHg.5)
碳酸钠ACo
磷酸鸟纳(NHCO
充分揽拌落解后，（保存。
A.4 PRST μH7.4
氯北豹Na1>
禁化押(KC)
酸二豆钾（KHPO,
磷胶瓶二缺（NHP012H0)
吐温2J
据均后,4保存。
A.5底物OPII溶液μH5.C
U.1mal/L两酸氢二纳(Na,Hr)
C. 1 Iel/L 柠替酸
t. u> trI.
3JnL凝台成底物稀释设
在101底物筛波中人的等蒙一胶P然后人S的双水H效5不色他用（像用前配制）。
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