【地方标准】 马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种鉴定技术规程

内蒙古自治区地方标准 DB15/T1604—2019 马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种鉴定技术规程 本标准规定了马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种鉴定的培养基配置、病样采集、晚疫病菌的分离纯化与鉴定、鉴别寄主的准备、人工接种、病情调查、生理小种确定、菌株保存、鉴定后材料的灭活处理等内容，适用于马铃薯晚疫病菌分离保存与生理小种的室内鉴定。 1 范围 本标准适用于马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）的分离、保存与生理小种的室内鉴定。 2 术语和定义 2.1 生理小种 生理小种是病原物种内在形态相似的情况下，存在培养性状、生理、生化、病理或其他特性上的差异的生物型或群体。 2.2 单孢分离 通过实体显微镜挑取单个孢子，并在特定条件下培养萌发成菌丝体，从而获得纯菌种的方法。 2.3 鉴别寄主 用于鉴别马铃薯晚疫病菌生理小种的马铃薯品种，一般含有R1、R11等抗性单基因及不含R基因作为对照。 2.4 人工接种 在人工控制条件下，用马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液接种到马铃薯鉴别寄主的叶片上，根据接种叶片孢子囊产生情况及不同寄主的组合情况来确定菌株的生理小种。 2.5 接种体 用于人工接种的马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液。 2.6 离体叶片接种法 将接种体接种到马铃薯鉴别寄主的离体小叶片上的方法。 3 培养基的配置 3.1 黑麦培养基 将50g黑麦与适量自来水混合，浸泡20至36小时后匀浆，水浴加热至55℃至60℃，过滤，补水至1000mL，加入12g琼脂，分装后121℃高压灭菌25分钟。 3.2 选择性培养基 在冷却至40℃的黑麦培养基中加入20mg/L利福平、200mg/L氨卡青霉素或100mg/L五氯硝基苯。 4 病样采集 在晚疫病流行期间，采集具有典型症状的新鲜病叶，记录品种、采样时间和地点。将病叶放入保鲜袋或薯片夹中带回实验室，储存于4℃冰箱中备用。 5 晚疫病菌的分离纯化与鉴定 5.1 保湿培养分离法 将采集的病叶清洗干净，晾干后放入湿滤纸的培养皿中，置于18℃至20℃的培养箱中培养1至2天。然后取病斑上的霉层置于选择性培养基中，继续在18℃至20℃培养7至9天，待菌落直径长至2至3厘米。 5.2 薯片夹叶分离法 取健康薯块清洗干净后，浸泡在75%乙醇中30至40秒，然后晾干表面残留的乙醇。将薯块切成5mm厚的片，放入灭菌的培养皿中。取约1cm病健交界处的病叶组织夹入两片薯片之间，在18℃至20℃培养箱中培养，待薯片上生长出霉层后，将霉层接种到选择性培养基中。 5.3 纯化 通过单孢分离后挑取单孢菌落，将其培养备用。 5.4 鉴定 挑取分离的少量培养体，制成玻片在100倍显微镜下观察菌体形态，若与附录A中的形态特征一致，则确定为晚疫病菌。 6 鉴别寄主的准备 将鉴别寄主的脱毒苗移栽到MS培养基上，经过15至20天的培养后，移栽至无土基质中，并浇施营养液，在20℃至23℃下继续培养约30天，待苗木健康生长后备用。