【地方标准】 小反刍兽疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法

小反刍兽疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法

1 范围
本标准规定了小反刍兽疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的技术要求，适用于在生物安全II级（BSL-2）以上实验室开展小反刍兽疫病毒病的诊断、监测及流行病学调查。适用于动物血液、血清、淋巴结及口鼻棉拭子样本中的PPRV核酸检测。

2 规范性引用文件
本文件引用以下标准和规范：
GB/T 19495.2-2004《转基因产品检测实验室技术要求》；中华人民共和国农业部公告第302号《兽医实验室生物安全技术管理规范》；农业部关于印发《病死及病害动物无害化处理技术规范》的通知（农医发〔2017〕125号）。

3 缩略语
PPRV：小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus）
RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）
RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）
DEPC：焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate）
bp：碱基对（base pair）
RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）
PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution）
TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris-acetate-EDTA buffer）

4 原理
本方法针对小反刍兽疫病毒高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含有病毒基因组模板时，PCR扩增反应得以进行并释放荧光信号。通过实时荧光定量PCR仪对信号强度进行监测，实现对检测结果的定性分析。

5 仪器和器材
5.1 台式冷冻离心机（0～20000 r/min）
5.2 冰箱（4℃±1℃、-20℃±1℃、-80℃±1℃）
5.3 全自动荧光定量PCR仪（ABI 7000、ABI 7300、ABI 7500、ABI 7900、Bio-Rad CFX384 Touch、CFX96 Touch等）
5.4 离心管（15 mL、1.5 mL、0.2 mL）
5.5 微量可调移液器（100～1000 μL、20～200 μL、10～100 μL、5～50 μL、2～20 μL、0.5～10 μL、0.2～2 μL）

6 试剂和引物
6.1 RNA抽提试剂：Trizol（淡粉色，4℃保存）
6.2 氯仿（-20℃预冷），异丙醇（-20℃预冷）
6.3 DEPC水：去离子水加入0.1% DEPC，37℃处理1h或室温过夜后121℃±1℃高压灭菌15 min
6.4 75%乙醇：由无水乙醇与DEPC水配制，-20℃预冷
6.5 阳性对照：PPRV细胞培养物