【国家标准(GB)】 饲料中氨基酸的测定

GB/T 18246—2000
本标准是根据FAO/WHO（联合国粮食及农业组织和世界卫生组织）植物蛋白评价组专家联席会的推荐，在GB/T15399—1994《饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法》GB/T15400--1994《饲料中色氨酸测定方法分光光度法》国家标准和NY/T56--1987（原GB7649—1987)《谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法行业标准的基础上，充分吸纳国内外有关研究的最新成果和两次参加国际大型氨基酸实验室间联合试验研究的经验与结果制定的。本标准的酸水解部分和国际公职分析化学家协会（AOACInternational)的最新方法《饲料氨基酸测定方法》具有相同的构架，但补充了碱解色氨酸的离子交换色谱和高效液相色谱法，增加了酸提取添加氨基酸的测定。
本标准对饲料氮基酸不同水解、测定方法的适应场合与局限性做了全面综合、归纳和阐述，改进了有关国家标准的有如样品量、粒度和蒸发去酸温度等实验条件。但是，考虑我国具体情况，本标准未像A(AC法那样采用内标法，而采用了外标法；在酸解法中，除以偏重亚硫酸钠做终止剂的氧化酸解法外，其他水解法也未采用AOAC和欧共体标准通用的回流水解法，而采用了真空封管水解法。在碱解法中，未用AOAC的氢氧化钠做碱解剂，而是沿用了NY/T57-1987（原GB7650--1987）《谷物籽粒色氨酸测定法》中的碱解剂一一氢氧化锂，这也是与德国等国家的做法相一致的。本标准达到了与AOAC等方法同样的准确度和精密度。在具体应用中，一般可用常规直接水解法测定除色氨酸和含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）以外的蛋白水解氨基酸，用氧化酸解法测定含硫氨基酸，而用碱解法测定色氨酸。但使用者可根据自已的测定目的，在本标准不同方法中组合、择用。本标准的附录A是标准的附录
本标准由农业部和全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：国家饲料产品质量监督检验中心（北京）。本标准参加起草单位：中国农业科学院畜牧研究所、吉林省农业科学院大豆研究所和农业部谷物质量检测中心。
本标准起草人：常碧影、张瑜、阎惠文、张明、梁维英、李静梅。2
1范围
中华人民共和国国家标准
饲料中氨基酸的测定
Determination of amino acids in feeds本标准规定了饲料中氨基酸的测定方法。GB/T 18246—2000免费标准bzxz.net
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、单一饲料和预混料中氨基酸总量和添加游离氨基酸的测定。
酸、碱水解法适于含动、植物蛋白的单一饲料、配合饲料、浓缩饲料和预混料中氨基酸总量的测定。酸水解法不能测定色氨酸，其中常规水解法适于测定除含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸等）以外的蛋白水解氨基酸；氧化水解法在以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，适于测定除酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸，在以氢溴酸为终止剂时,适于测定除酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸以外的蛋白水解氨基酸。碱水解法只适于色氨酸的测定。
酸提取法适于配合饲料、预混料和浓缩饲料中添加氨基酸，主要是赖氨酸、蛋氨酸含量的测定，也可用于苏氨酸等其他添加(游离)氨基酸含量的测定。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法（eqvISO5983：1979）GB/T6433—1994饲料粗脂肪测定方法（eqvISO5983：1979）GB/T15399-1994饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法3方法原理
3.1酸水解法
常规（直接）水解法是使饲料蛋白在110C、c(HCI）=6mol/L盐酸作用下，水解成单氮基酸，再经离子交换色谱法分离并以三酮做柱后衍生测定。水解中，色氨酸全部破坏，不能测量。胱氮酸和蛋氨酸部分氧化，不能测准。氧化水解法是将饲料蛋白中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用过甲酸氧化，然后进行酸解，再经离子交换色谱分离、测定（详见GB/T15399）。水解中色氨酸破坏，不能测定。酪氨酸在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时，被氧化，不能测准。酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢溴酸作终止剂时被氧化，不能测准。3.2碱水解法
饲料蛋白在110C、碱的作用下水解，水解出的色氨酸可用离子交换色谱或高效反相色谱（见附录A)分离、测定。
3.3酸提取法
饲料中添加的氨基酸以稀盐酸提取，再经离子交换色谱分离、测定。国家质量技术监督局2000-10-24批准2001-04-01实施
4试剂和材料
GB/T18246—2000
除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水，电导率小于1S/m。4.1酸水解法
4.1.1常规水解
4.1.1.1酸解剂-盐酸溶液，c(HC1)=6mol/L：将优级纯盐酸与水等体积混合。4.1.1.2液氮或干冰-乙醇（丙酮)。4.1.1.3稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，pH2.2，c（Na+）=0.2mol/L：称取柠檬酸三钠19.6g，用水溶解后加入优级纯盐酸16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，加水定容至1000mL，摇匀，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗过滤，备用。
4.1.1.4不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按仪器说明书配制。4.1.1.5节三酮溶液：按仪器说明书配制。4.1.1.6氨基酸混合标准储备液：含L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规蛋白水解液分析用层析纯氨基酸，各组分浓度c（氨基酸）一2.50（或2.00）μmol/mL。4.1.1.7混合氨基酸标准工作液：吸取定量的氨基酸混合标准储备液（4.1.1.6)置于50mL容量瓶中，以稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.1.1.3)定容，混匀，使各氨基酸组分浓度c（氨基酸）一100nmol/mL。
4.1.2氧化水解
按GB/T153991994中7.1氧化水解步骤操作。4.2碱水解法
4.2.1碱解剂一-氢氧化锂溶液c(LiOH)=4mol/I:称取一水合氢氧化锂167.8g，用水溶解并稀释至1000mL，使用前取适量超声或通氮脱气。4.2.2液氮或干冰-乙醇（丙酮）。4.2.3盐酸溶液，c(HCI)=6mol/L：配制方法同4.1.1.1。4.2.4稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，pH4.3，c(Na+）=0.2mol/L：称取柠檬酸三钠14.71g、氯化钠2.92g和柠檬酸10.50g，溶于500mL水，加入硫二甘醇5mL和辛酸0.1mL，最后定容至1000mL。4.2.5不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液与节三酮溶液：按仪器说明书配制。4.2.6L-色氨酸标储备液：准确称取层析纯L-色氨酸102.0 mg·加少许水和数滴0.1mol/I.氢氧化钠，使之溶解，定量地转移至100ml,容量瓶中，加水至刻度。c（色氨酸）=5.00μmolml。4.2.7氨基酸混合标准储备液：同4.1.1.6。4.2.8混合氨基酸标准工作液：准确吸取2.00mLL-色氨酸标准储备液和适量的氨基酸混合标准储备液，置于50mL容量瓶中并用pH4.3稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.2.4）定容。该液色氨酸浓度为200nmol/ml，而其他氨基酸浓度为100nmol/mL。4.3酸提取法
4.3.1提取剂—-盐酸溶液，c(HCl）=0.1mol/L：取8.3ml.优级纯盐酸，用水定容至1000ml，混匀。
4.3.2不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按仪器说明书配制。4.3.3节三酮溶液：按仪器说明书配制。4.3.4蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准储备液：于三只100mL烧杯中，分别称取蛋氨酸93.3mg、赖氨酸盐酸盐114.2mg和苏氨酸74.4mg，加水约50mL和数滴盐酸溶解，定量地转移至各自的250ml容量瓶中，并用水定容。该液各氨基酸浓度c（氨基酸）=2.50μmol/mL。4.3.5混合氨基酸标准工作液：分别吸取蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准储备液各1.00mL于同一25ml.容量瓶中，用水稀释至刻度。该液各氨基酸的浓度c（氨基酸）=100nmol/ml。222
5仪器、设备
5.1实验室用样品粉碎机。
5.2样品筛：孔径0.25mm。
5.3分析天平：感量0.0001g。
5.4真空泵与真空规。
5.5喷灯或熔焊机。
5.6恒温箱或水解炉。
GB/T 18246--2000
5.7旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控温精度土1℃，真空度可低至3.3×103Pa（25mm汞柱）。
5.8氨基酸自动分析仪：节三酮柱后衍生离子交换色谱仪，要求各氮基酸的分辨率大于90%。6样品
取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25g左右，粉碎并过0.25mm孔径（60目）筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。
酸水解样品按GB/T6432测定蛋白质含量。碱水解样品，按GB/T6433测定粗脂肪含量。对于粗脂肪含量大于、等于5%的样品，需将脱脂后的样品风干、混匀，装入密闭容器中备用。而对粗脂肪小于5%的样品，则可直接秤用未脱脂样品。7分析步骤
7.1样品前处理
7.1.1酸水解法
7.1.1.1常规水解法：称取含蛋白7.5~25mg的试样（约50~100mg，准确至0.1mg）于20ml安中，加10.00mI.酸解剂（4.1.1.1）,置液氮或干冰（丙酮）中冷冻，然后，抽真空至7Pa（≤5×10-2mm汞柱）后封口。将水解管放在（110士1）℃恒温干燥箱中，水解22～24h。冷却，混匀，开管，过滤，用移液管吸取适量的滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中、60（，抽真空，蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1～2次。加入3～5mLpH2.2稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.1.1.3)，使样液中氨基酸浓度达50~250nmol/ml，摇匀，过滤或离心，取上清液上机测定。7.1.1.2氧化水解法：按GB/T15399—1994中7.1规定操作。7.1.2碱水解法：称取50~~100mg的饲料试样（准确至0.1mg），置于聚四氟乙烯衬管中，加1.50ml碱解剂（4.2.1），于液氮或干冰乙醇（丙酮）中（4.2.2)冷冻，而后将衬管插入水解玻管，抽真空至7Pa（≤5×10-2mm汞柱），或充氮（至少5min），封管。然后，将水解管放入（110士1）C恒温干燥箱，水解20h。取出水解管，冷至室温，开管，用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.2.4)将水解液定量地转移到10mL或25mL容量瓶中，加入盐酸溶液（4.2.3)约1.00mL中和，并用上述缓冲液定容。离心或用0.45um滤膜过滤后，取清液贮于冰箱中，供上机测定使用。7.1.3酸提取法：称取1～2g饲料试样（蛋氨酸含量≤4mg，赖氨酸可略高）,加0.1mol/L盐酸提取剂（4.3.1)30mL，搅拌提取15min，沉放片刻，将上清液过滤到100mL.容量瓶中，残渣加水25mL，搅拌3min，重复提取两次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗提取瓶和滤纸上的残渣，并定容。摇勾，清液供上机测定。若试样提取过程中，过滤太慢，也可离心10min（4000r/min）。测定赖氨酸时，预混料和浓缩饲料基质会有较大干扰，应针对待测试样同时做添加回收率实验，以校准测定结果。7.2测定
用相应的混合氨基酸标准工作液（如4.1.1.7、4.2.8或4.3.5等）按仪器说明书，调整仪器操作数和（或）洗脱用柠檬酸钠缓冲液的pH，使各氨基酸分辩率≥85%，注入制备好的试样水解液科Hi应的283
GB/T18246-2000
氨基酸混合标准工作液，进行分析测定。酸解液每10个单样为一组，碱解液和酸提取液每6个单样为一组，组间插入混合氨基酸标准工作液进行校准。8分析结果的表述
分别用式（1)和式（2），计算氨基酸在试样中的质量百分比：×10-°×D×100
wi:(%)
wz(%）=
2 × (1 - F) × 10- × D × 100m
式中：i:用未脱脂试样测定的某氨基酸的含量，%；2-—用脱脂试样测定的色氮基酸的含量，%；Ati-—每毫升上机水解液中氨基酸的含量，ng；A2-—-每毫升上机液中色氮酸的含量，ng；m-
-试样质量，mg；
D-试样稀释倍数；
F-一-样品中的脂肪含量，%。
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。9允许差
++++( 1 )
对于酸解或酸提取液测定的氨基酸，当含量小于或等于0.5%时，两个平行试样测定值的相对偏差不大于5%；含量大于0.5%时，不大于4%。对于色氮酸，当含量小于0.2%时，两个平行试样测定值相差不大于0.03%；含量大于、等于0.2%时，相对偏差不大于5%。281
GB/T 18246—2000
附录A
(标准的附录）
色氨酸测定反相高效液相色谱(RP-HPLC)法除测定时将氨基酸分析仪更换为反相液相色谱仪、相应的洗脱用柠檬酸钠缓冲液更换为下述流动相，以及用下述具体的仪器测定条件外，其试剂、设备、样品前处理以及结果计算、表述和允许差等均同正文。
A1液相色谱仪
具适当内径、长度和柱材粒度的C18柱（如25cm×4.6mm内径的μ-BondapakC18柱）、紫外(UV)或荧光检测器。
A2流动相，乙酸钠缓冲液[c(Na+）=0.0085mol/L的乙酸钠溶液用乙酸调节pH至4.0，用0.45um的滤膜过滤］+甲醇=95+5。
A3测定
条件：柱温：室温；
流动相流速：1.5mL/min；
检测：紫外检测波长：280nm；
荧光检测：激发波长：283nm；
发射波长：343nm；
进样量：15uL
先从混合氨基酸标准工作液开始分析，每6个水解液为一组，组间插入氨基酸标准工作液（4.2.8）进行校准。
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