【地方标准】 水产品中副溶血性弧菌检测 实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法

DB32/T4234—2022
水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法

前言
本文件按照GB/T 1.12020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由南京农业大学提出并归口。本文件起草单位：南京农业大学、江苏省淡水水产研究所、上海海关动植物与食品检测中心、南京市产品质量监督检验研究院、广东省科学院微生物研究所、杭州傲敏生物科技有限公司。本文件主要起草人：薛峰、朱晓华、申进玲、蒋原、张驰、薛亮、汤芳、戴建君、吴清平、梁莹、任建鸾、赵凯颖、张正荣。

1 范围
本文件规定了水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aid Amplification，RAA）法的试剂材料、仪器设备、检测程序、操作步骤、结果判定和报告、检出限及防止污染措施。
本文件适用于水产品中副溶血性弧菌检测及水产品副溶血性弧菌的快检初筛。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.7 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aid Amplification，RAA）：一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，在恒温下（一般为37℃～42℃）进行核酸扩增的技术。

4 原理
RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统的热循环解链过程。根据副溶血性弧菌的特异性基因序列，结合荧光探针检测法对水产品中的副溶血性弧菌进行判定。经实时荧光RAA扩增后，根据样品在30min内是否出现扩增曲线，可判定样品结果。

5 试剂材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。试剂材料有：
a) 探针和引物
根据副溶血性弧菌的特异性基因序列设计探针和引物。
表1 副溶血性弧菌探针和引物
致病菌种类：副溶血性弧菌
引物探针名称：上游引物 th-F、下游引物 th-R、exo探针 th-P
目的基因：th
序列 (5'-3')：
th-F: TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCG
th-R: TTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTC
th-P: [FAM-dT-THF-BHQ-dT]...SpacerC3
b) 试剂
1) RAA反应缓冲液：20% PEG，280 mmol/L 醋酸镁（MgAc2）。也可采用等效的商品试剂盒。
2) 冻干酶制剂：1 mmol/L dNTP、90 ng/μL 单链结合蛋白、120 ng/μL recA重组酶、30 ng/μL Bsu DNA聚合酶、30 ng/μL ExoII、100 mmol/L Tricine、20% PEG、5 mmol/L 二硫苏糖醇、100 ng/μL 肌酸激酶，保存于200μL反应管中。也可采用等效的商品试剂盒。
3) 阳性对照：副溶血性弧菌标准菌株 ATCC 17802，或含目的片段的DNA；
阴性对照：非副溶血性弧菌标准菌株，或不含目的片段的DNA；
空白对照：无菌水。

6 仪器和设备
包括以下几种：
a) 荧光检测仪：带有恒温（39℃±1℃）扩增功能的荧光检测仪；
b) 微量移液器：0μL~2.5μL，1μL~10μL，20μL~200μL，100μL~1000μL，并配备与移液器匹配的吸头；
c) 高速台式离心机：离心力≥12000g；
d) 恒温水浴锅或金属浴：39℃±1℃；
e) 天平：感量0.01g。

7 检测程序
副溶血性弧菌实时荧光RAA检测程序见图1：
样品处理和增菌 $ ightarrow$ 细菌DNA提取 $ ightarrow$ 实时荧光RAA扩增 $ ightarrow$ 结果观察 (阴性/阳性) $ ightarrow$ 传统方法确认 $ ightarrow$ 报告。
水产品参照 GB 4789.7 执行。

8 样品处理和增菌
8.1 样品处理和增菌
8.2 细菌模板DNA的制备
8.2.1 试剂盒法
使用商品化DNA提取试剂盒，以及适量获得的增菌液，按其说明提取制备模板DNA。
8.2.2 煮沸法
8.2.2.1 吸取8.1获得的增菌液1mL加入15mL离心管中，10000g离心1min，弃上清。
8.2.2.2 加入1mL无菌水，充分悬浮沉淀，10000g离心1min，弃上清。
8.2.2.3 加入100μL无菌水混匀后沸水浴（或95℃金属浴）10min，置冰上冷却。
8.2.2.4 10000g离心1min，上清液即为模板DNA。
8.3 实时荧光RAA扩增
8.3.1 实时荧光RAA反应体系
副溶血性弧菌RAA检测，50μL反应体系见表2。