【国家标准(GB)】 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法

GB/T17480-1998
酶联免疫吸附(ELISA)法测定黄曲毒素B(AFB),是近20年来发展起来的一种新的分析方法。它比原GB8381一87薄层荧光限量法（半定量）测定AFB1具有技术先进、灵敏度高、特异性强、精确度高、重复性好、测定速度快、成本低、污染少等优点。其原理是通过AFB，抗体与酶标AFB1抗原和待测抗原之间免疫竞争反应以及酶的催化显色反应相结合来检测样品中AFB，的含量。国外已研制成专门的测试盒供检测部门使用，如美国Agri-Screen等公司就有这种产品。本标准等效采用AOAC(美国公职分析化学家协会）中关于棉籽制品和混合饲料中AFB,酶联免疫吸附筛选法，该法1989年首次在AOAC上获得通过。本标准为饲料中AFB1限量和定量测定法，可与原GB8381一87标准并列使用，而以原标准为仲裁法。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由江苏省微生物研究所、上海市饲料质量监督检验站、国家饲料质量监督检验中心（北京）、上海市嘉定纤检仪器厂共同组成的起草工作组负责起草。本标准主要起草人：成恒嵩、播中华、张瑜、陈必芳、宓晓黎、赵晓联、衰建兴、杨焱、徐燕芳、葛其德。220
1范围
中华人民共和国国家标准
饲料中黄曲霉毒素B1的测定
酶联免疫吸附法
Determination of aflatoxin B, in feeds--Enzyme-linked immunosorbent assayGB/T17480—1998
本标准规定了饲料中黄曲霉毒素B,(AFBi)的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本标准适用于各种饲料原料、配(混)合饲料中AFB1的测定。2 引用标准
GB8381-87饲料中黄曲霉毒素B,的测定方法3原理
利用固相酶联免疫吸附原理，将AFB特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再如入样品提取液（未知抗原）及酶标AFB1抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标AFB抗原结合的量，即样品中AFB1多，则被抗体结合酶标AFB，抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法或仪器法与AFB,标样比较来判断样品中AFB,的含量。4试剂和材料
4.1AFB酶联免疫测试盒组成
4.1.1包被抗体的聚苯乙烯微量反应板：24孔或48孔。4.1.2A试剂：稀释液，甲醇：蒸馏水为7：93(V/V)。4.1.3B试剂：AFB，标准物质（Sigma公司，纯度100%)溶液，1.00μg/L。4.1.4C试剂：酶标AFB,抗原（AFBI-辣根过氧化物酶交联物，AFB.-HRP）,AFB,：HRP（摩尔比）<2:1。
4.1.5D试剂酶标AFB,抗原稀释液，含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的pH7.5磷酸盐缓冲液(PBS)。pH7.5磷酸盐缓冲液的配制：称取3.01g磷酸氢二钠（Na2HPO.·12H,0）,0.25g磷酸二氢钠(NaH,PO·2H,O),8.76g氯化钠(NaCI)加水溶解至1L。4.1.6E试剂：洗涤母液，含0.05%吐温-20的PBS溶液。4.1.7F试剂：底物液a，四甲基联苯胺（TMB），用pH5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液配成浓度为0.2-g/L。pH5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液配制：称取15.09g乙酸钠（CHCOONa·3H,O），1.56g柠檬酸（C.HO，·H,O)加水溶解至1L。
4.1.8G.试剂：底物液b，1mLpH5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液中加入0.3%过氧化氢溶液28μL。4.1.9 H试剂;终止液,c(H,SO)=2 mol/L 硫酸溶液。国家质量技术监督局1998-08-28批准1999-01-01实施
GB/T 17480—-1998
4.1.101试剂：AFB，标准物质（Sigma公司，纯度100%)溶液，50.00μg/L。4.2测试盒中试剂的配制
4.2.1.C试剂中加入1.5mLD试剂，溶解，混匀，配成试验用酶标AFB,抗原溶液，冰箱中保存。4.2.2E试剂中加300mL蒸馏水配成试验用洗涤液。4.3甲醇水溶液：甲醇：水为5：5(V/V)。5仪器、设备
5.1小型粉碎机。
5.2、分样筛：内孔径0.995mm（20目）。5.3分析天平：感量0.01g。
5.4滤纸：快速定性滤纸，直径9~10cm。5.5微量连续可调取液器及配套吸头：10~～100uL。5.6培养箱：(0～50℃）±1℃，可调。5.7冰箱：4～8℃。
5.8AFB，测定仪或酶标测定仪，含有波长450nm的滤光片。6分析步骤
6.1取样
按GB8381-87中5.1要求采集、处理样品，制成分析用的试样如果样品脂肪含量超过10%，粉碎前应用乙醚脱脂，再制成分析用试样，但分析结果以未脱脂计算。
6.2试样提取
称取5g试样，确至0.01g，于50mL磨口试管中，加入甲醇水溶液25mL，加塞振荡10min，过滤，弃去1/4初滤液，再收集适量试样滤液。根据各种饲料的限量规定和B试剂浓度，按表1用A试剂将试样滤液稀释，制成待测试样稀释液。表1
每干克饲料中AFB,限量，μg
6.3限量测定
试样滤液量，mL
6.3.1洗涤包被抗体的聚苯乙烯微量反应板A试剂量，mL
稀释倍数
每次测定需要标准对照孔3个，其余按测定试样数，截取相应的板孔数。用E洗涤液洗板2次，洗液不得溢出，每次间隔1 min，并放在吸水纸上拍干。6.3.2加试剂
按表2所列，依次加入试剂和待测试样稀释液。222
加入量
GB/T17480-1998
待测试样稀释液
注：表中1号孔为空白孔，2号孔为阴性孔，3号孔为限量孔，4～12号孔为试样孔。6.3.3反应
放在37℃恒温培养箱中反应30min。6.3.4洗涤bzxz.net
将反应板从培养箱中取出，用E洗涤液洗板5次，洗液不得溢出，每次间隔2min，在吸水纸上拍千。
6.3.5显色
每孔各加入底物F试剂和底物G试剂各50μL，摇匀，在37℃恒温培养箱中反应15min。目测法判定。
6.3.6中止
每孔加终止液H试剂50μL。仪器法判定。6.3.7结果判定
6.3.7.1目测法：先比较1～3号孔颜色，若1号孔接近无色（空白），2号孔最深，3号孔次之（限量孔，即标准对照孔），说明测定无误。这时比较试样孔与3号孔颜色，若浅者，为超标；若相当或深者为合格。6.3.7.2仪器法：用AFB，测定仪或酶标测定仪，在450nm处用1号孔调零点后测定标准孔及试样孔吸光度A值，若A试样孔小于A3号孔为超标，若A试样孔大于或等于A3号孔为合格。试样若超标，则根据试样提取液的稀释倍数，推算AFB，的含量（见表3）。表3
稀释倍数
6.4定量测定
每千克试样中AFB，含量，μg
若试样超标，则用AFB测定仪或酶标测定仪在450nm波长处进行定量测定，通过绘制AFB，的标准曲线来确定试样中AFB，的含量。将50.00μg/L的AFB,标准溶液用A试剂稀释成0.00、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00μg/L的标准工作溶液，分别作为B试剂系列，按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值A；以0μg/LAFB浓度的A。值为分母，其他标准浓度的A值为分子的比值，再乘以100为纵坐标，对应的AFB，标准浓度为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。根据试样的A值/A。值，乘以100的值在标准曲线上查得对应的AFB，量，并按式（1)计算出试样中AFB，的含量。223
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—-每千克试样中AFB,的含量，μg；式中：—
从标准曲线上查得的试样提取液中AFB：含量，μg/LV-试样提取液体积，mL，
n试样稀释倍数;
m—试样的质量，g。
7精确度
重复测定结果相对偏差不得超过10%。8其他
测试盒应放在4～8℃冰箱内保存,不得放在0℃以下的冷冻室内保存。8.1
测试盒有效期为6个月。
8.3凡接触AFB,的容器，带浸入1%次氮酸钠(NaCIO,)溶液，半天后清洗备用。8.4为分析人员安全，操作时要带上医用乳胶手套。224
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