【其他行业标准】 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法

ICS 07.060;13.060 Z17 HY 中华人民共和国海洋行业标准 HY/T 151—2013 海洋微藻中溶血毒素的检测（血细胞法） Detection of hemolytic toxins in marine microalgae — Erythrocyte lysis assay 发布日期：2013-04-25 实施日期：2013-05-01 发布单位：国家海洋局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局南海环境监测中心提出，由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口。本标准由国家海洋局南海环境监测中心、暨南大学负责起草。主要起草人：李秀芹、杨维东、黄楚光、徐志斌、高阳、彭颖慧、上官茂森、林端、方宏达、吴进孝、董燕红、陈嘉辉、吴玲玲、曲念东、刘洁生。 1 范围 本标准规定了采用血细胞法检测海洋微藻中溶血毒素活性的方法及技术要求。本标准适用于自然海水及实验室培养的海洋微藻细胞中溶血毒素的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注明日期的引用文件，仅该日期版本适用于本文件；凡未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB 17378.3—2007 海洋监测规范 第3部分：样品采集、贮存与运输 HY/T 069—2005 赤潮监测技术规程 3 术语和定义 3.1 海洋微藻（marine microalgae） 指海水中粒径大于2 μm的浮游植物。 3.2 溶血毒素（hemolytic toxins） 指由微藻产生的一类能够导致红细胞及其他真核细胞裂解的糖脂类物质，主要作用于细胞膜脂质部分。 3.3 溶血活性（hemolytic activity） 指溶血毒素溶解血细胞的能力。 3.4 溶血单位（hemolytic units） 用于表征溶血毒素活性的量纲。在1 mL反应体系中（含0.15 mL柠檬酸缓冲液、0.80 mL 0.5%兔血红细胞悬液和0.05 mL溶血毒素粗提液），于37℃水浴30 min使红细胞溶解50%所需的毒素量定义为1个溶血单位，相当于（1.30±0.39）μg洋地黄皂苷。 3.5 血细胞法（erythrocyte lysis assay） 基于溶血毒素破坏血细胞的特性建立的检测方法，以溶血单位为量纲定量溶血毒素的活性。 3.6 赤潮水样（red tide water） 指微藻细胞浓度达到或超过HY/T 069—2005规定基准浓度的海水样品。 3.7 非赤潮水样（non-red tide water） 指微藻细胞浓度未达到HY/T 069—2005规定基准浓度的海水样品。 4 原理 采用氯仿、甲醇和水按体积比13:7:5组成的提取液，对微藻细胞中的溶血毒素进行萃取。提取液经减压蒸馏浓缩后，用甲醇溶解残留物，得到溶血毒素粗提物。将粗提物与血细胞反应，同时配制洋地黄皂苷标准系列溶液绘制标准曲线，根据溶血程度计算溶血毒素活性。 5 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或等效纯水。 5.1 氯仿（CHCl3）。 5.2 甲醇（CH3OH）。 5.3 柠檬酸（C6H8O7·H2O）。 5.4 洋地黄皂苷（≥99%）。 5.5 氯化钠（NaCl）。 5.6 柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）。 5.7 葡萄糖（C6H12O6）。 5.8 曲拉通X-100。 5.9 医用肝素钠注射液（5000 IU/mL）。 5.10 提取液：氯仿、甲醇和水按体积比13:7:5配制。 5.11 柠檬酸溶液（2 mol/L）：称取柠檬酸42.0 g，溶于适量水并定容至规定体积。