【国家标准(GB)】 TK基因突变试验

ICS 07. 100
中华人民共和国国家标准
GB15193.20—-2003
TK基因突变试验
TK gene mutation test
2003-09-24发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-05-01实施
GB15193.20-2003wwW.bzxz.Net
本标准全文强制。
本标准参考美国FDA营养素补充剂与食品安全中心食品添加剂安全办公室发布的“食品成分安全评价毒理学原则2000年版红皮书（2001年9月发布）：IV.C.1.c.小鼠淋巴瘤胸腺嘧啶激酶基因突变试验(IV.C. l. c. Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Gene Mutation Assay)”。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：四川大学华西公共卫生学院、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：张立实、张建清、帅培强、王怡净。本标准首次发布。
1范围
TK基因突变试验
本标准规定了体外哺乳类细胞TK位点基因突变试验的基本技术要求与方法。GB15193.20-2003
本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。
2原理
TK 基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidine kinase，TK)基因的突变。在人类，TK基因定位于17号染色体长臂远端；在小鼠厕定位于11号染色体。故TK基因的突变于常染色体基因突变。
TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷（TdR)生成胸苷酸（TMP)的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加人胸苷类似物（如三氟胸苷，即TFT一-trifluorothymidine)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺人DNA，造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺人DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数,计算突变频率，以判定受试物的致突变性。3试剂与材料
3.1细胞：L5178Ytk/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。为清除自发突变的tk-7基因型细胞，在正式实验前，应使用含3μg/ml.胸苷,5μg/mL次黄嘌呤，0.1ug/mL氨甲碟呤和7.5μg/mL甘氨酸的THMG培养基中处理24 h，离心、洗涤后在不含氨甲碟呤的THMG培养基中培养3天。3.2试剂：PBS磷酸盐缓冲液，三氟胸苷（trifluorothymidine），次黄嘌呤（hypoxanthine），甘氨酸（gly）cine），氨甲碟呤（methotrexate），胸腺嘧啶核苷（thymidine），阳性对照物（MMS，MMC,环磷酰胺等）。4试验设计
一般应进行细胞毒性预试验，根据预试验结果，在相对存活率(relative survival,RS)为阴性对照组的20%～80%范围内设3个～4个剂量（浓度）水平。每次试验均需设阴性（双蒸水）对照，通常亦需设阳性对照。阳性对照通常使用MMS、EMS、MMC、CP(环磷酰胺）等。如使用非水溶剂，则亦需设溶剂对照。
5操作步骤
5.1培养液和培养条件：含10%马血清和适量抗菌素的RPMI1640培养液（96孔板培养时使用含20%马斑清的RPMI1640培养液），5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。5.2处理：取生长良好的细胞，调整密度为5×10/mL，按1%体积加人受试物，37℃震摇处理3h。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×10°/mL。125
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