【国家标准(GB)】 体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基固突变试验

ICS07.100
中华人民共和国国家标准
GB15193.12—2003
代替GB15193.12—1994
体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）
基因突变试验
V79/HGPRT gene mutation test2003-09-24发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-05-01实施
GB15193.12—2003
本标准全文强制。
本标准代替GB15193.12—1994《体外哺乳类细胞（V79/HGPRT)基因突变试验》。本标准与GB15193.12—1994相比主要修改如下：在“范围”中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保溅、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。自本标准实施之日起，GB15193.12—1994同时废止。本标推由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：冯继农、高芃本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。82
1范围
GB 15193.12—2003
体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变试验本标准规定了体外哺乳类细胞（V79/HGPRT)基因突变试验的基本技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。
2原理
细胞在正常培养条件下,对6-TG的毒性作用敏感，不能生存,在致癌物和/或致突变物作用下,某些细胞X染色体上控制次黄嘌呤鸟嘌吟磷酸核糖转移酶（HGPRT)的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT,从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6-TG的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。3材料和试剂
3.1细胞：使用中国仓鼠肺(V79)细胞株。为了减少自发突变率，正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发HGPRT座位突变体选择性杀灭，方法是将野生型细胞接种于含次黄嘌呤及胸腺嘧啶、氨甲噪呤、甘氨酸的MEM培养液中培养1周，然后重新接种于MEM培养液中。3.2培养液：采用MEM(Eagle)基础培养液或DMEM培养液，补以10%小牛血清及适量抗菌素（青霉素、链霉素）。
3.3磷酸盐缓冲液（无钙、镁PBS）磷酸二氢钾（KHPO）
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)
氯化钾（KC1）
氯化钠(NaCI)
双蒸水
高压消毒，121℃，0.103MPa.20min。200mg
1000mL
3.4胰蛋白酶/EDTA溶液：用无钙、镁PBS配制，胰酶的浓度为0.05%，EDTA的浓度为0.02%，胰蛋白酶与EDTA溶液按1：1混合。一20℃储存。3.5受试物：最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚砜（DMSO)，其浓度应低于0.5%（体积分数）。3.6阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如乙基磺酸酯（EMS)，丝裂霉素 C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍（MNNG)，苯并(a)芘(BP)等。3.76-TG：用0.5%碳酸氢钠溶液配成1.0mg/mL，4℃储存。3.8大鼠肝匀浆S-9混合液：按Ames试验程序制备。4操作步骤
4.1细胞准备：将5×105个细胞接种于直径为100mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中放置24h。
4.2接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加人无血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者同83
GB15193.12—2003
时加人大鼠肝勾浆S-9混合物），置于培养箱中2h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换人含10%血清的培养液，继续培养19h~22h。4.3表达：接触受试物的细胞继续培养19h～22h后用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加人含10%血清培养液终止消化，混勾，放人离心管以800r/min1000r/min的速度离心5min～7min，弃去上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105个细胞接种于直径为100mm的平血，3天后分传一次，仍接种5×105个细胞培养3天。
4.4细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5%二氧化碳条件下培养7天，固定，Giemsa染色，计数每Ⅲ集落数，以相对于溶剂对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶剂对照的集落形成率为100%（1.00），求出各检品试验组的相对值。A(%)
式中：
A-相对集落形成率；
B——试验组集落形成率；
C—一溶剂对照组集落形成率。
.*(1 )
4.5突变体的选择及集落形成率的测定：表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿种2×105个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG，终浓度为5μg/mg，放入培养箱培养8天～10天后固定，Giemsa染色，统计每血集落数，并计算突变率。同时另做集落形成率测定。每皿接种200个细胞，不加6-TG，每组5个皿，7天后固定染色，计算集落形成率。D=号
式中：
D——集落形成率;
E—实际存活的细胞集落数；
式中：
接种细胞数。
G——突变率；下载标准就来标准下载网
H—突变集落数；
I——接种细胞数;
D—集落形成率。
5结果判定
5.1若阴性对照中，集落形成率低于50%,结果应不采用。...( 2)
5.2各实验室选用的阳性对照突变率有一定范围,若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下限以上，否则结果不能成立。5.3当突变率为自发突变率的3倍或3倍以上，或至少在3个浓度范围内突变率有随浓度递增而升高的剂量反应关系时，可判为阳性。84
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