【HG化工标准】 稳定性同位素 15N 标记的三肽

ICS 71. 0B0. 99
备案号：27305—2010
中华人民共和国化工行业标准
HG/T4106—2009
稳定性同位素15N标记的三肽
Stable isotope 15N labelled tripeptide2009-12-04发布
2010-06-01实施
中华人民共和国上业和信息化部发布
TTY KAONY KAa
稳定性尚位素5、记的三肽
本标雅的附录A为资料性附录。
本标滩由中国石油和化学「业协会提出。言
本标准由全国肥料征土壤调理剂标准化技术委员会(SAC/TC105)归口,本标准由上海化工研究院负责起节。本标准主要起节人：杜晓宁、果明鸣、李美华、刘卫霞、张亮。本标准屑苔次发布。
IIG/T4106—2009
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1范围
稳定性同位素15N标记的三肽
HG/T4106--2009wwW.bzxz.Net
本标雅规定了稳定性同位素标记的三肽的技术要求、试验方法,检验规则、标志、包装、运输和。
本标准适用于以相应的氨基酸为原料，逆过 Fr10c 固相胀合成法制备的稳定性同位素5 N 标记的三肽产品。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标雄的引用而成为本标准的条献。凡是注Ⅱ期的引用文件，其随斥所有的修政单（不包括勘谈的内容)或修订版均不适用丁本标谁，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件.其最新版本适用于本标推：GB/T601化学试剂滴定分析(量分析)用标雅济液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法G[3/T20622—2006稳定性同位素15V无机标记化合物3符号与缩略语
3.1同位素原子的表示：”A
其中A表尔儿素符号,m表示该儿素的同位素的原子质量数。例如：15√表示氮儿素中质量数为15 的同位素氮原子。
3.2同位素丰度的单位表示：atom%A裁示 A儿素的质量数为 m的源子占 A素的原子白分数，例如:atom%1N表示质量数为15 的同位素氮原了在氮元素中所占的原了分数。atom为*A可用缩略形式at.%\A表示。4技术要求
4.1产品的技术要求应符合表1的要求表1产品的技术指标
15N标记的三肽质量分数/%
15N同位素丰度/(L.2%1N)
5试验方法
优级品
白包粉末
标明值
合格品
白色粉末
标明值
本实验方法所用试剂、辫液除另有规定外，均应符合GB/T 601和GB/T 603 中规定的要求，高效液相色谱分析用水应符合GB/T6682中一级水规格，H其余实验室用水应符合GB/T6682中三级水1
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规格。
除外观以外，各技术要求同时做三份平行样品的测定，5.1外观
日视捡测。
5.2含量高效液相色谱法。
5.2.1方法原理
高效液相色谱法测定三肽含量：用天然丰度氨基酸作为外标，测定15N标记肽中相应15N标记氨基酸的含量,即为一肽的含量。
一肽中各氨基酸之间以肽键（一NH一CO一）相连，肽键在盐酸中会发生断裂，水解而形成游离氨其酸。氮基酸的 N 端氨基在缓冲液存在的条件下与 2,4-二硝基氟莱(Sanger 试剂)衔生生成黄色的 2,4-(二硝基苯基)氨基龄，可在适当的色谱条件下进行定量检测。5.2.2试剂和材料
5.2.2.1盐酸：分析纯；
5. 2. 2.2
苯酚：分析纯，需重蒸馏：
5. 2. 2. 3
氨甚酸对照品:生化试剂,其氨基酸含量不小于97%，5. 2. 2. 4
乙睛：色纯；
盐酸水溶液：1+1；
5.2.2.6乙月水溶液：311，
5. 2. 2. 7
乙酸钠溶液：0.05mol/L；
苯酚盐酸溶液：向100mL盐酸溶液（1+1)中加人1ml.茶酚，混勾：盐酸溶液：0.1mol/L，量取9mL盐酸注入1000ml.水巾，摇勾；5.2.2.9
5.2.2.10碳酸钠缓冲溶液：pH=9.0,将0.2mol/1.的碳酸钠溶液与0.2Inol/L的碳酸氧钠溶液按1：9的体积比混合，摇匀；
5.2.2.11磷酸氢钠缓冲溶液：pH=7.0,将0.2mo1/L的磷酸氢二钾液与0.2mo1/L的磷酸二氢钾溶液按6：4的体积比混合·摇句；5.2.2.12衍生试剂：1%2,1-二硝基氟苯的乙睛落液。5.2.3仪器和设备
5.2.3.1通常实验室用玻璃仪器及设备；5.2. 3.2
高效液相色谱仪，配备紫外检测器：5. 2. 3. 3
恒温干燥箱，可控制温度（150士5）℃：5.2.3.4
1水彝管：玻璃小管，5mmX50mm；5.2.3.5
反应瓶：耐压螺盖硬质玻璃瓶，体积20nL~30mL，5. 2. 3. 6
真空T燥箱，温度可调节，真空度可达一0.1MPa5.2. 3.7
涡旋混合器；
犬平十力分之一。
5.2.4分析步骤
5.2.4.1样品水解
称量(0.5～1.0)mg15N标记三肽试样,精确到(0.01 rng。称好-的样品置于水解管中,亚将水解管置于干燥反应瓶中，30℃真空1燥1h。向反应瓶巾加人苯酚盐酸溶液，用氮气置换瓶内经气15s，迅速拧紧反应瓶螺丝盖。将反应瓶置于（15C±5℃的恒温干爆箱内水解2h，取出冷却至室温，将水解管外壁的盐酸擦去，放入另，于燥反应瓶中30℃真空十燥3h。同时称取与1V标记三肽水解得到的氮基酸量相当量的氮基酸对照品，采用同样的方法进行水解，真空于燥。5.2.4.2样品衍生
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从T焕反应瓶取出水解管.加0.1mof/L盐酸溶液50μL、碳酸钠缓冲溶液200l，涡旋混合，再从吸取100μL至1ml离心管中，加人衔衍生试剂（5.2.2.12)100μL，祸旋混合后放人水浴箱中60℃水浴反应1h，取出水辉管。冷却至室温，加人磷酸氢钠缓冲溶液800l，涡旋混合。采用同样的方法处理氨基酸对照品水解产物。5.2.4.3样品测定
待高效液相仪器稳定后，将5.2.4.2处理得到的氨基酸对照品衍生液和15N标记一肽衍牛液利用高效液相色谱仪测定试样的含量。5.2.4.3.1色谱条件
色谱柱：Ca（200mX4.6mm.5m）；柱温：30℃；
逃样量：5㎡L#
检测波长：360nm；
流速:1.0 mL/min;
流动相,A为乙晴水溶液,B为醋酸钠溶液;洗脱条件：梯度洗脱，梯虚表如表2。表215N标记三肽液相分析梯度表耐间/min
流速/mL/min
5.2.515N标记三肽的含量计算与表述非N标记三胀的含量按以下方法得到，15N标记一肽水解液小待测氢基酸的浓度按式(1)计算：C
式中：
H--二肽水解液中待测氨基峻的峰高对应值：Cst
-氮基酸对照品溶液的浓度，出其物质的量和0.1mol/L盐酸溶液的休积计算可得，单位为毫摩尔每察升（mmal/mt.)
氨非酸对照品溶液的峰高对应值。1N称记“最的含量以X计，数值以质量分数表尔，按式(2)计算：X-
我中：
三胀水解液中氨基酸的浓度，单位为亳摩尔每毫(mimol/mI.)；三肽的相对分子质量；
水解反应后问水解管中加入溶剂0.1mal/1.盐酸的体积，单位为毫升（ml.)；肽试料的质量数值，单位为毫克（mg）。注：用于计算15下标记二肽含量的Map中的氮元案的率尔质量数应接照不同卡度的实际值计算得到。(2)
例：非标记三肽中氮元素的摩尔质量数为14.01，15N丰度97%的标记三肽中氮素的摩尔质量数=14×(1-0.97)1-15X0.97—14.97HG/T 4106—2009
5.2.5.1允许差
3次乎行测定结果的绝对偏差≤1.0%。5.315N同位素丰度液质联用送
5.3.1方法原理
液质联用测定三肽的1iN同位素丰度：利用高效液相色谱自动进样，济分离水解得到的氨基酸组分,在电喷雾离了化的条件下,采用负离子模式测定三肽水解被中的不同氮基酸及其同位素的准分子离子峰强度，根据相关的离了峰独度计算得出待测氨基酸的N同位素丰度值。5.3.2试剂和材料
5.3.2.1中醇：色谱纯：
5.3.2.2 纯水：电导率18 MO;
5.3.2.3甲醇水溶液，111
5.3.2.4乙酸铵溶液:0.01 mol/L5.3.3仪器和设备
5.3.3.1通常实验案用玻璃仪器及设备。5.3.3.2液相色潜串联四极杆质谱联用仪：液相色谱应配备紫外或PDA阵列检测器和梯度洗脱泵，质谱应配备电喷雾(ESI)离子源。5. 3. 3. 3 高纯氮气,99. 999 %。5.3.4分析步骤
5.3.4,1样品测定
将5.2.4.1处理得到的试样用中醇水溶液(5.3.2.2)溶解,并加人少量的Z酸铵溶液混勾，抽滤试液，以白动进样方式进行液相色谱和质谱联用检测其15V度值。5.3.4.2色谱条件
色谱柱;C(150mmX4.6mm,5μm)
柱温：室湿：
进样量5 μI
检测波长：PDA全波段；
流速:0. 3 nl./ min
流动相:A相:甲醇,B相:纯水：
洗脱条件：等度洗脱，A/B=25：75。5.3.4.3质谱条件
离了化模式：火气压电喷雾离子源（ES1)！喷雾电压：2800V;
雾化气压：137.90kPa(20psi)：辅助气压力:68.95 kPa(lpsi);
离子传输毛细管温接:270℃：
扫捕模式：负离子模式Q1MSFullScan。5.3.515N标记三肽氨基酸组分的15N丰度讨算与表述待测-5V标记氨基酸同位索丰度，以E计，数值以at.乐正N表示，在质谱测得的总离子流图的各个氢基酸峰最高处选取【～2点得到相应质谱图，取各氨基酸及其相应间位紊峰的平均值作为计算相应氢基酸的15同位素丰度值的依据。根据所得的各分子离子蜂的强度值，按式(3)计算其1\N牛度值：
ImXnX0. 011-+-IrM-.×100
Im+I[ I:]+I[-2
TYYKAONKACa
++*+(3)
5N标记氨氮基酸分子离子峰的相刘强度；木被1iN标记的氨基酸分子离子峰相对强度；15N标记氨基酸中所含有的碳原了数；白然界碳元素中C同位素的含量：0. 011-
15N标记氮基酸巾天然度13C资献的分子离了峰相对强度利，5.3. 5. 1允许差
3 次平行测定结果的相对偏差≤0. 5%，6检验规则
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6.-1以每一次通过Fmoc.固相肽合成法制备得到的产品为一批。每批样品的采样，应用消洁干燥的匙勺从容器的四个等分的中间部位等量采样：采样量约为5mg-~10m：混合均勾后装人两个清浩干燥Ⅱ密封良好的塑料瓶巾，瓶上的标签应注明生产厂名、产品名称，批批量、采样量、采样日期和采样人姓名。一瓶作产品质量分析，另-瓶作为留样，留样应低温保存(冰箱冷冻室即可)6个月。6.2产品检验部门按本标推规定逊行检验，所有出厂产品都应符合本标准要求。如果检验结果不符合木标准要求，应重新自该批产品中瑕双倍样行检验。重新检验结巾即使有一项指标不符合外标准要求也应判该批产品不合挤。
7标志，包装、运输和贮存
7. 1 标志
7..1.1每批出厂产品应附有质量证明书，内容有：牛产厂名，厂址、产品名称、分子式、净含量、15N的丰度值、产品含量、生产批号、H期、本标准号和检验员签字。7. 1.2每个内包装单元上应有标签,内容有:生产厂名、产品名称、分子式、净含量、15V同位索丰度值、品含量、生产口期。
7.1.3外包装上应印有生产厂名、厂址、产品名称、批号、总质量和本标准号，7.2包装
7.2.1内包装：采用医用塑料瓶或色谱用小样品瓶，瓶子的容积根据客需求选定。瓶口用铝塑膜封口，塑料瓶盖带有次性树边。
7.2.2外包装：在内包装外用(0.3~0.5）mmPVC塑料膜密封，再用钙塑箱包装。7.3运输和存
7.3.1本产品在运输与些存时，应通风干燥，防止雨淋和受潮受热，贮运温度应不高丁0℃。7. 3.2本产品经检验合格后些疗期为 2 年。HG/T 4106—2009
附录A
(资料性附录）
三肽水解衍生原理
三肽中各氨基酸之间以肽键（一NH一CO—)相连，肽键在盐酸中会发生断裂，水解而形成游离氮基酸。氨基酸的N-端氨基在缓冲液存在的条件下与2，1-二硝基氟苯（Sanger试剂)衍生生成黄色的2,4-（一硝苯)氨基酸，可在适当的色谱条件下近行定量检测。F+H.NCHCONHCHCONII
NHCHCO.H+H.NCHCOaHI--
N(2,4三硝基苯基)氮据酸
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-NHCHCONHCHCONH
中华人民共和H
化工行业标雅
稳定性同位素15N标记的三肽
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山版发行：化学T业出版社
（北京市东城区青年湖南街13号邢政编码1000-1）北京云浩印刷有限责任公司印装889mm×1230mm1/16印张字数13千字2010年$万北京第1版第1次印制
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