【GB国家标准】 基因表达的测定 蛋白印迹法

ICS 07.080 A21 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 38477—2020 基因表达的测定 蛋白印迹法 Determination of gene expression-Western blot 2020-11-19发布 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布 2020-11-19实施 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：河北医科大学、中国标准化研究院、河北省食品检验研究院、中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心、中国医科大学、河北师范大学。 本标准主要起草人：吕品、马爱进、张岩、赵伟东、曹鹏秀、赵美承、王宁。 1 范围 本标准规定了用蛋白印迹（Western blot）法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤和结果分析。 本标准适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 基因表达 gene expression 将储存在DNA分子中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。 3.2 缩略语 BSA：牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin） ECL：增强型化学发光（Enhanced Chemiluminescence） SDS：十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate） SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis） TBS：Tris缓冲盐溶液（Tris Buffered Saline） TBST：Tween-20/Tris缓冲盐溶液（Tween-20/Tris Buffered Saline） 4 原理 SDS-PAGE分离的蛋白质转移到转印膜上后，先用抗目的蛋白质的一抗与转印膜上的蛋白质反应，再利用带标记的二抗与一抗反应，最后根据二抗标记物的特性检测微量蛋白质。 5 试剂或材料 5.1 总则 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.2 水 GB/T 6682，二级。 5.3 1 mol/L Tris-盐酸溶液 称取12.1 g Tris加入80 mL水溶解，用盐酸调pH后定容至100 mL。 5.4 2 mol/L氯化钠溶液 将117 g氯化钠加水溶解并定容至1000 mL。 5.5 0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液 称取18.61 g乙二胺四乙酸二钠二水合物，加水溶解，用氢氧化钠调pH至8.0后定容至100 mL。 5.6 动物细胞/组织总蛋白裂解液 由Tris-盐酸溶液、氯化钠溶液、乙二胺四乙酸溶液及其他组分配制，加水定容至100 mL，使用前加入蛋白酶抑制剂。 5.7 植物总蛋白抽提试剂盒 含裂解液和蛋白酶抑制剂。 5.8 1.5 mol/L Tris-盐酸（pH 8.8）溶液 将Tris溶解后用盐酸调pH至8.8并定容。 5.9 丙烯酰胺溶液 由丙烯酰胺单体与N,N'-甲叉双丙烯酰胺组成，过滤后避光保存。 5.10 十二烷基硫酸钠溶液 称取SDS加水溶解并定容。 5.11 过硫酸铵溶液 称取过硫酸铵加水溶解，分装后冷冻保存。 5.12 蛋白浓度测定试剂盒 含BSA标准品及染料试剂。 5.13 5×SDS上样缓冲液 由Tris-盐酸缓冲液、SDS、β-巯基乙醇、甘油及溴酚蓝组成，加水定容。 5.14 5×SDS-PAGE电泳缓冲液 称取甘氨酸和Tris加水溶解并定容至250 mL。使用时按比例稀释至工作浓度。取133 mL 5×SDS-PAGE