【行业标准】 粮油检验 粮油及制品中黄曲霉毒素含量测定 柱后光化学衍生高效液相色谱法

ICS67.060
中华人民共和国粮食行业标准
LS/T6122—2017
粮油检验
粮油及制品中黄曲霉毒素含量
柱后光化学衍生高效液相色谱法Inspection of grain and oils--Determination aflatoxin content in grains and oils-Cleanup by immunoaffinity chromatography and determination by high-performanceliquid chromatographyand post-column photochemical derivatization2017-10-27发布
国家粮食局
2017-12-20实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家粮食局提出。
本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270）归口。LS/T6122—2017
本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、北京市粮油食品检验所、湖北省粮油食品质量监测站、北京中检维康技术有限公司、北京农业质量标准与检测技术研究中心。本标准主要起草人：王松雪、王雄、呙琴、熊宁、谢刚、黎睿、张艳、张蕊、周明慧、陆安祥、1范围
粮油检验粮油及制品中黄曲霉毒素含量测定柱后光化学衍生高效液相色谱法LS/T6122-—2017
本标准规定了柱后光化学衍生高效液相色谱法测定粮食和食用植物油中黄曲霉毒素含量的原理、试剂和材料、仪器和设备、打样、试样制备、操作步骤、结果计算和精密度。本标准适用于粮油及制品中黄曲需毒素含量的测定（油料除外）。本标准中黄曲霉毒素B,、B;、Gl、Gz的定量检测限分别为0.5μg/kg、0.25μg/kg、1.0ug/kg和0.5μg/kgu
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T5524动植物油脂扦样
2分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682
GB/T15687动植物油脂试样的制备3原理
试样由甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释和免疫亲和层析柱净化后，用高效液相色谱进行分离，利用色谱柱后的光化学衍生器使分离物发生衍生反应，产生荧光信号，通过荧光检测器测定荧光强度，采用标准曲线法计算样品中黄曲等毒素的含量。试剂和材料
除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的规定。乙睛：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
氯化钠（(NaCl)
4.4甲醇+水（7+3）：取70mL甲醇（4.2)加30mL水。4.5甲醇+乙+水（35+10+55）：取35mL甲醇（4.2）和10mL乙晴（4.1）加55mL水4.6黄曲霉毒素标准品（黄曲莓毒素BI、B2、GI、G）：纯度≥99%。4.7黄曲霉毒素标准储备溶液：准确称取适量黄曲霉毒素标准品（4.6），用乙睛（4.1）或甲醇（4.2）分别配制2μg/mL的黄曲霉毒素B、B2、G、G2标准储备液，保存于4℃备用，有效期3个月。注：考虑到黄曲筹毒素具有致瘤性，用粉末配制标准储备液在安全以及量值保障方面有很多不确定因素，建议直接购买商品化的黄曲霉毒素标准溶液4.8黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素BI、B2、G、G。标准储备溶液（4.7)，用1
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甲醇十乙十水（4.5）定容为混合标准工作液。系列混合标准工作液中B，浓度分别为0.5ug/L、1.0uμg/L、5.0ug/L、10.0g/L、20.0μg/L、50.0ug/L。Bz、G、G，浓度以B浓度为基础，按4：1：4：1(B：B2：GiiG)比例配制。
仪器和设备
玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。容量瓶：2mL。
玻璃注射器：20mL。
微量注射器：100L。
黄曲霉毒素免疫亲和柱，柱容量≥200ng：回收样品筛：20目筛网礼径0.850mm。粉碎机。
8000/min~22000r/min。
高速均质器
空气压力
5.10振荡器
普衍生器：紫外灯
分析天平感量0.01
高效液相色谱仪：具有
6扦样
254连接于色借挂后出门端与荧光检测器相连，360m激发波
发射波
长的荧光险测器。
和420
所取样品应具有代表性并自在运输和贮存的过程中无损坏或变扦样方法推荐采用GB15524租GE
7试样制备
用粉碎机（5.7粉碎各物类样品使其全部通过20目样品筛（5.6），混匀，装入洁净容器内作为试样，密封备用。
植物油试样制备依据GB/T15687执行。取样前充分混合样品。凝固的固体样品需完全熔化，以保证充分混合。
8操作步骤
8.1提取
谷物类样品：称取25g试样（精确至0.1g）于1000mL均质杯（5.8）巾，加人5g氯化钠（4.3）及125.0mL（V）甲醇+水（7+3)（4.4）以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移取15.0mL（V2）滤液并加人30mL(V.）水稀释，用玻璃纤维滤纸（5.1)过滤1次~2次，至滤液澄清，备用，植物油样品：称取5.0g试样（精确至0.01g）于50mL离心管，加1.0g氯化钠（4.3）及25.0mL（V）甲醇十水（7+3)（4.4）。涡旋均匀后，以35r/min振荡30min，在7000r/min转速下离心5min。吸取并充去油层后过滤提取液，取15mL滤液（V，），加30mL（Vs）水稀释混匀，用玻璃纤维滤纸（5.1）过滤1次～2次，至滤液澄清，备用。2
8.2净化
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将免疫亲和柱（5.5)连接于20mL注射器（5.3）下端。移取15.0mL(V）样品提取液（相当于1.0g样品）注入注射器（5.3)中，将空气压力泵（5.9）与注射器（5.3）上端连接，调节压力使溶液以约6mLmin流速缓慢通过免疫亲和柱，直至液体全部流出，有空气通过。以水淋洗柱子2次，每次10.0mL，弃去全部流出液，直至空气通过柱休。加人1.0mL甲醇（4.2）洗脱，流速为1mL/min～2ml./min，收集全部洗脱液于2.0mL容量瓶（5.2)中，用水稀释至刻度（V），混匀后供色谱测定。8.3测定
8.3.1高效液相色谱参考条件wwW.bzxz.Net
高效液相色谱参考条件如下：
色谱柱：Cis柱（柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm）流动相：甲醇+乙腈+水（35+10+55）（4.5）：流速：1.0
nL/min;
d）柱温：3
进样体积：20uL
f）光化学衍生器：紫外灯251mng）检测器：炭光检测器激发波长nm
标准曲线制作
上述色普条件下，基线平稳质制作工作标准曲线。分别吸取不同浓度标准混合落液（4.8)20进样分析以黄曲雷毒素BB、G、G的色谱峰峰面积对相应标准工作溶液浓度作图：分别耐作黄曲毒素B，、B的，作标准曲线。黄曲霉毒素B、B2、G1、G标准品的高效液相色语图参见附录8.3.3试样分析
取20L试样溶液（8.2)进行液相色谱测定。外标法定量。空自试验
除不加试样外，按8.3.1~8.3.3步骤做空试验，9
结果计算
黄曲霉毒素各组分含量
按式（1)计算试样中黄曲霉毒素各组分（B、B，、Gl或G）的含量（μg/kg），式（1)中W按式（2）计算。
式中：
(G1-C.)XV
试样中某一黄曲霉毒素（B、Bz、G、G）的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；进样溶液中某一黄曲霉毒素（Bi、B2、GI、G.)的含量，单位为微克每升（ug/L)；空白试验进样溶液某一黄曲霉毒素（BI、BzGG2)的含量，单位为微克每升（μg/L)；（1）
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式中：
最终定容体积，单位为毫升（tnL)；最终净化洗脱液所含的试样质量，单位为克（g）。W=m
试样称取量，单位为克(g)；
提取液总体积，单位为毫升（mL）；V
稀释用样品滤液体积，单位为毫升（mL）；稀释液体积，单位为毫升（mL）；用于免疫亲和柱净化的稀释提取液体积，单位为毫升（mL）。黄曲霉毒素总含量
试样黄曲霉毒素总含量为黄曲霉毒素B、B2、G和G2含量之和，按式（3)计算：X=EX,
式中：
X—试样中总黄曲霉毒素（B、B2、G和G.)含量，单位为微克每千克（ug/kg）。9.3结果表示
以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。4
·（3)
（资料性附录）
黄曲霉毒素标准溶液高效液相色谱图6-
99801-1
6621-14
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黄曲霉毒素B,、B2、G，、Gz（浓度比例4：1：4：1)的标准溶液高效液相色谱图图A.1
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中华人民共和国粮食
行业标准
粮油检验
粮油及制品中黄曲霉毒素含量
柱后光化学衍生高效液相色谱法测定
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2017年12月第一版 2017年12月第一次印刷*
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