【行业标准】 水稻二化螟抗药性监测技术规程 毛细管点滴法

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T20582011
水稻二化抗药性监测技术规程
毛细管点滴法
Technological rules for monitoring insecticide resistance in striped stemborer,Chilo suppressalis Walk.,using topical application method2011-09-01 发布
中华人民共和国农业部
2011-12-01实施此内容来自标准下载网
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学。NY/T20582011
本标准主要起草人：邵振润、沈晋良、李永平、胡君、张帅、高聪芬、何月平、周威君、苏建亚1范围
NY/T2058—2011
水稻二化蝶抗药性监测技术规程毛细管点滴法
本标准规定了毛细管点滴法监测水稻二化螺对杀虫剂抗性的基本方法。本标准适用手水稻二化对具触杀作用的有机氯、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、沙蚕毒素类、苯基吡唑类、昆虫生长调节剂及大环内酯类等常用杀虫剂的抗性监测。2仪器设备
电子天平(感量0.1mg)：
天平（感量1g）；
培养皿(小培养皿：直径5cm，高1.2cm;大培养皿：直径18.5cm，高3cm)；养虫笼（长23cm×宽23cm×高32cm）：青霉素瓶(容量为5mL)：
移液管或移液器；
容量瓶(10mL、25mL）：
玻璃广口瓶或果酱瓶（瓶底直径8cm，高10cm)；毛细管点滴器：容积通常为0.04μL～0.06μL（精确度为0.01μL)：钢精锅（中号：直径24cm，高13cm：大号：直径33cm，高18cm)；调节电炉（电压220V，功率1000WX2)；白色瓷盆（长30cm、宽20cm、高4.5cm)：手提式压力蒸汽灭菌器：
恒温培养箱、恒温养虫室或人工气候箱。3试剂与材料
3.1生物试材
3.1.1试虫：水稻二化螺(ChilosuppressalisWalk.）3.1.2水稻品种：采用感虫品种汕优63或一种当地有代表性的、非抗虫杂交水稻品种。3.2试验药剂
杀虫剂原药。
4试验步骤
4.1试材准备
4.1.1试虫采集
选当地具有代表性的水稻秧田或本田3块以上，采集二化卵块100块以上；或白天在田间用捕虫网、养虫笼等丁具捕提成虫或夜晚在黑光灯下诱集成虫200头以上，供室内饲养。4.1.2试虫饲养
4.1.2.1成虫产卵
采集的成虫放入恒温培养箱中的养虫笼中，相对湿度为85%～90%，在未用药处理的感虫、生长嫩绿的秧苗上分批产卵（1d～2d一批），所产卵块分批在恒温培养箱中培育至黑头。1
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4.1.2.2幼虫饲养
将大田采集或室内饲养已黑头的卵块接人栽有5cm～6cm高稻苗的玻璃广口瓶或果酱瓶中（每瓶幼虫密度控制在约100头），置于温度为28℃土1℃、光周期为16h：8h(L：D)的恒温培养箱、恒温养虫室或人工气候箱中，设弱下光照，以免幼虫逃逸。饲养至生理状态一致、体重范围在每头6mg～9mg的4龄幼虫供试。
4.1.3供试水稻
取一定量水稻种子在适宜的温度下（一般28℃）浸种2d，催芽露白后，播人玻璃广口瓶或果酱瓶中，瓶口封上一层保鲜膜并扎少量透气孔，置于适宜的温度下培养，待稻苗长至5cm～6cm时即可供初孵幼虫饲养用。
4.1.4试验人工饲料
按附录A配制人工饲料，并于4℃冰箱中储存，或可现做现用。试验前从冰箱中取出，待回温至室温，即可用于毒力测定试验。每培养皿加长约2cm、厚约0.5cm的条状饲料供饲养幼虫用。4.2药液配制
在电子天平上用容量瓶称取一定量的原药，用有机溶剂（如丙酮等，杀虫单、杀丹等用体积为1：1的丙酮：水混合液）溶解，配制成一定浓度的母液。用移液管或移液器吸取一定量的母液加入青霉素瓶，用上述溶剂配制成一定质量浓度的药液供预备试验，根据预备试验结果，再按照等比法用青霉素瓶配制5个～7个系列质量浓度，每个浓度的药液量不宜少于2mL。4.3处理方法
挑取每头体重为6mg～9mg4龄幼虫置于盛有人工饲料的培养皿中，每皿5头，每浓度重复6次，共30头。供试药液浓度按从低到高的顺序处理，用容积为0.04μL～0.06uL的毛细管点滴器将药液逐头点滴手幼虫胸部背面，以点滴内酮（或内酮：水=1：1）为空白对照。处理后将培养血转移至温度为28℃土1℃，光周期为L：D=16h：8h条件下饲养和观察。4.4结果检查
分别于处理后48h（有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类、有机氯类等杀虫剂）、72h（大环内酯类和苯基吡唑类杀虫剂）、96h（沙蚕毒素类条虫剂）、120h（昆虫生长调节剂类杀虫剂）检查试虫死亡情况，记录总虫数和死虫数。
数据统计与分析
死亡率计算方法
根据调查数据，计算各处理的校正死亡率。按式(1)和式(2)计算，计算结果均保留到小数点后两位。
式中：
P—死亡率，单位为百分率(%)；K表示每处理浓度总死亡虫数，单位为头；N一表示每处理浓度总虫数，单位为头。P
式中：
P2校正死亡率，单位为百分率(%)P—处理死亡率，单位为百分率(%)：X100
Po空白对照死亡率，单位为百分率(%)。2
对照死亡率<20%应按式(2)进行校正；对照死亡率≥20%，试验需重做。5.2回归方程和半致死剂量计算方法NY/T2058—2011
采用SAS、EPA、Polo、BA、DPS等统计软件的机率值分析法进行统计分析，求出每个药剂的毒力回归方程式、LDso值及其95%置信限、b值及其标准误。6抗性水平的计算与评估
6.1部分杀虫剂对水稻二化螺的敏感毒力基线（参见附录B）6.2抗性水平的计算
根据敏感品系的LDso值和测试种群的LDso值，按式(3)计算测试种群的抗性倍数(RR)，计算结果均保留到小数点后一位。
6.3抗性水平的评估
测试种群的LDs0
敏感品系的LDs0
（3）
根据抗性倍数的计算结果，按照表1中抗性水平的分级标准，对测试种群的抗性水平作出评估。表1抗性水平的分级标准
抗性水平分级
敏感性下降
低水平抗性
中等水平抗性
高水平抗性
极高水平抗性
监测报告编写
抗性倍数，倍
3.0≤RR<5.0
5.0≤RR<10.0
10.0≤RR<40.0
40.0≤RR<160.0
RR≥160.0
根据统计结果和抗性水平评估，写出正式抗性监测报告，并列出原始数据。3
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A.1人工饲料配方
附录A
（规范性附录）
水稻二化蝶人工饲料配方和制备水稻二化人工饲料配方见表A.1。表A：1
水稻二化螺人工饲料配方
组分编号
2人工饲料配制的操作步骤
葡萄糖
酪蛋门（干酪素）
干酵母
麦芽粉
稻茎叶粉
威氏盐
胆固醇
氯化胆碱
山梨酸
自来水
1%甲醛
抗坏血酸钠
A.2.1根据饲养种群的数量，确定所需配制人工饲料的量（如用表A.1配方的5倍或10倍量等）。在天平（感量1g）上分别称取表A.1中1号～10号人工饲料组分，倒入钢精锅（中号）内,加入所需水量的1/2，搅拌均匀，盖上锅盖放入高压锅内蒸煮，喷气后15min即可拔除电源，等待自动放气或慢慢人为放气；
在天平（感量1g）上称取琼脂，放入钢精锅（大号）中，并加入另外1/2水量，在调节电炉上边煮边搅，以防焦枯；
琼脂完全煮溶化后，
将上述钢精锅内蒸煮的混合物倒入琼脂锅内，充分混匀：A.2.3
4冷却至55℃后，加入抗坏血酸钠、甲醛，充分混匀；A，2.5稍冷却（待锅中上层开始凝固）后，倒入大培养血或白色塘瓷盆内，冷却后加盖或封上保鲜膜。放入冰箱备用。
附录B
（资料性附录）
部分杀虫剂对水稻二化敏感毒力基线NY/T2058-
2000年和2002年采集于黑龙江省五常市二化幼虫，在室内不接触任何药剂的情况下用汕优63杂交稻及人工饲料在室内传代饲养，得到敏感品系，已建立的敏感毒力基线见表B1。部分杀虫剂对二化螺敏感品系（Hwc-s)的毒力基线表B.1
阿维菌素
氟虫腊
辛硫磷
三唑磷
毒死蝉
杀蟆硫磷
二嗪磷
敌百虫
乙酰甲胺磷
虫酰肼
杀虫单
LD-P线
16.553+3.0725X
19.841+4.9672X
17.338+5.2746X
11.911+3.1340X
15.661+5.1388X
14.623+4.7241X
15.593+7.6081X
8.809+3.3573X
6.5371+4.0588X
7.7348+1.5092X
8.7410+5.3268X
6.1721+2.1494X
注：HwC-s表示在黑龙江省五常市采集到的二化敏感品系。LDso（95%置信限）
μg/头
0.00017(0.00014~0.0002)
0.0010 (0.0009~0.0012)
0.004 6 (0.003 9~0.005 2)
0.0062(0.0051~0.0074)
0.0084(0.0073~0.0095)
0.0092(0.0080~0.0103)
0.00405(0.0368~0.0458)
0.0734(0.06100.0891)
0.4181 (0.3509~0.498 5)
0.0154(0.0107~0.0208)
0.198 5 (0.176 5~0.223 2)
0.2849(0.22930.3579)
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