【国家标准】 伊氏锥虫病诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
CB/T 23239-—2009
伊氏锥虫病诊断技术
Diagnostic techniques for Trypanosomosis evansi2009-03-09发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T23239—2009
本标准的制定参期广世界动物卫生组织（OIE）编写的《陆生动物诊断试验和疫手册（哺乳动物、含鸟与蜂)(第五版，2004)。
本标准的附录A,附录B和附求C为资料性附录本标推出中华人民共和国农业部提出：本标雄由全国动物际按标准化技术委员会归1。本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所，本标准主要起草人：周金林，沈杰，品伙伴网http：//foodmate.net1范围
伊氏锥虫病诊断技术
GB/T 232392009
本标准规定了新鲜血件、擀血涂片染色、毛细管集虫、实验动物接种等病原整定力法和乳胶凝集试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验技术，本标准适用于伊氏锥取病的诊断、检疫、流行病学调查。2临床诊断
依家畜种类不同，临床症状表现不同。马（骤、驴）一般早急性经过，感染后，体温突然升高到40%以上，稽留数日，而后经短时间的间隙，再行发作，体表水肿为常见症状，结膜和第三眼脸常有出血斑。黄牛、水牛及骆驼等一般呈慢经过，有不定期的间歌发热，食欲不振，消瘦，肿脚和耳、尾于枯症状，许多慢性感染病例无明显病变。
有以上临床症状者，可以怀疑感染，确诊需要实验室检验。3病原监定
3.1采血样
可从耳静咏或属静脉采取外周血，从颈静脉或其他大静脉采取深部血液，因伊氏锥虫喜欢寄生于深部而液，处于低出而症时，外周血检山率常低于深部血的50%。3.2新鲜血片检查
在干净载玻片上滴上一小滴鲜血，盖［盖玻片，使而液扩散成为细胞单层，再用光学显微镜（200倍）观察活动锥亚。为防止血液在观察时干酒，也可先在载玻片滴血时加-滴牛现盐水或3%柠檬邀三钠生理盐求。
3.3薄血膜染色检查
将·小滴而放在清消载玻片一端约20mm处，按常用方法成薄血膜，迅速风下用甲醇固定2min，于燥后，再灿t姬氏染色液（配法参见附录A）染色25min，倾去染色锨，自来水冲洗，1燥后用400倍～1000倍显微镜检查。
3.4毛细管集虫检查
3.4.1材料准备
肝素处理过的毛细管（管内径1.5In，长75mm的玻璃或无色透明的硬质塑料管，在拟进血的端吸人3%肝钠10mt1,用烤箱70℃~80℃烤干后备用），显微镜一台，离心机一台，裁玻片，盖玻片，12号以上注射针头（或金属针），塑泥（橡皮）：3.4.2来集待检血样
从动物耳静脉或尾静脉穿刺获得脏液，先用酒精棉擦净拟采血处皮肤，干后用针头穿刺血管，血流山时用毛细管吸人达40mm深（即70），封未沾染血的另一端（可用塑泥或火焰加热封闭）3.4.3集虫
以3000g离心10mi，待红细胞全部沉积于毛细管下半部，上层为黄色血浆时即可，3.4.4检查
在毛细管的血浆与红细胞分界绒下1mm处将管折断（切断、剪断），将带有少堂红细胞的血浆滴于载玻片上，盖上益玻片，使血液扩散成细胞单层，在350倍~100倍放大的光学显微镜下检查活虫，如需进一步详细观察虫体，可再除去盖玻片，晾下血片后，用姬氏染色液染色后，在800倍1500倍放大的显微镜下观察确定。
GB/T 23239--2009
3.5动物接种
采被检动物血0.25mL,加人灭菌阿低较（或3头柠檬酸三钠牛:现盐水)0.25rn,经腹腔注射入小白鼠（大自鼠则现倍量），每周3次从尾部采血检查活寄生出，为提高销虫在小鼠体内培养繁殖的敏感性，可用环磷醋胺或醋酸氢化可的松抑剿小白鼠的免疫力：4血清学试验
4.1乳胶读集试验
4.1.1材料准备
4.1.1.1器材：乳胶凝集试验反应板，为是照色背景的璃梅用漆或油性色笔将板面分成（20mm-30 tu)×（20 tnm-~3C Emm)的方著竿个。25mL移液器（或μ200 μL可调移液器）或滴管。具叫升的有机玻离(或玻璃)面凝与粒板。4.1.1.2试剂：化学交联锥题抗
4.1.2分析步骤
4.1.2.1用移液器或滴
4.1.2.2用滴管在乳腹
4.1.2.3在各方格。
10 ℃时需延长 2 m
4.1.3结果判定
的胶诊断液,锥出病阳性征激阴性消，牛现盐水。颜盐水列被
血清、阴性血
金验反属
Rit观察
反应滋均匀色变为个
色则为阴性：如阿
精长出现
重做。
4.2间接血凝试
4.2.1材料准备
4. 2. 1. 1 器材:V形79
角）微量血
4.2.1.2试剂：键出病
接血凝诊
燥血纸，磷酸缓冲滤
4.2.2分析步骤
4. 2. 2. 1 先在血凝
4.2.2.2十左边租1
配法参见
虹清或屿
菲有细小白色
抗原致敏而球
阳性血清能1：氧稀释。
奇释的旗清
均，r内观察结果，室湿低于
观察。
散其中叫，如仍为琦勺白
弱操作有误器机推备不合格，需器，温箱。
致敏球悬液;阳性血清或阳性于
上排作测定靠，下排为对照排。稀释如用纸则剪取1.2cm
浸出液相当血清籍稀释。然后次每摔第2氣开始每孔加人缓冲血纸剪碎,加缓冲液 20
液50μ。
4.2.2.3从第1孔内吸取已趣消或面线没山液501.加人2孔离，再向右按次序作倍比稀释，共烯释到1G0倍(血)或(血纸%并吸取第1孔扇液50μL雄第2排第2孔内，按同样方法向右作倍比蒂释，最后孔中吸L稀释液丢筹4.2.2.4向测定排第2孔垒第6孔中馨抑等敏血球悬落1工，向对照排第2孔至第（孔中各加人非致敏血球悬液10μL(如表1)。表1
血消号
血洁稀彝伴数
r品伙伴网http：//foodmate.r80
阳性血清
致敏血球悬液10
方然摄
4.2.2.6用微型断熨板满器
1 h~2h有一小氯@可点，周国
央，图像为孔底受央有
沉予孔底中央，
较大红
爆孔底中央
4.2.3结果判门！
凡测定排障
对照排高出 2
排阳性反应孔
4. 2.4注意事期
应孔不到1
度或更多时
厚同者判为
诊断充分遥
4. 2. 4. 1
4.2.4.2如到
释度测定
第12孔为止，
4.2.4.3血纸勿被
泰虫爬
表1(续）
血清释释倍数
加缓弹
窗有少量面秘
GB/T23239—2009
阴性血清免费标准下载网bzxz
摄冲液
阴性血循
的窄刻照孔留一
个,分别加人致敏和非
置手26℃~30℃条件斤
液混匀
红而舞大部分沉于孔底中
为弱阳性，记录最“二”，红血球金部围液
无淡红色，叠阴，记录为“一”。及其以上录阳性反应，月测定排比个稀释度规为可疑。测定排与对照应再连缘稀覆下去，一直稀释到移液器在稀择感次次数要一致，测定排与对照排应分别各息4.2. 4. 4
4.3酶联免疫吸附试（
4.3.1材料准备
个感液器头下。
4.3.1.1器材：素苯乙烯酶标板、酶标仪L～200秘的可调秘蔽器（或25 uT.50μL、100 uL、200μ移液器）
4.3.1.2试剂：锥山可搭性抗原、辣根冠能物海标记娩抗牛IgG抗体、牛血消白蛋白、参考阴性血清、附性血请，PII9.6的0.05mnl/T.酸盐缓亦液、PII7.的PBS-吐温缓冲液、PH5.C的柠機酸盐级冲液<以上3种缓冲液配方参见附录C).邻米二胺、80%HU、2mol/1HS04.3.2分析步骤
4.3.2.1用pH9.6的0.05mol/L磷酸盐缓冲液将维虫抗原液稀释刻10μg/mL，向酶标板各孔内加人200,置于2℃~10℃冰箱中20h~24h。4.3.2.2倒去抗原液，用PBS-吡温缓冲液洗漆3次，再次5min，甩下。用PBS-吐温缓冲液游解牛血清白蛋白至1g/20mL，向各孔中加人250μL，置37湿盒内1h4.3.2.3例去白蛋白液，同上方法洗涤，凡下。将阴性、阻性而清和被检清均用PBS作1200称释，各孔中分别加入200，每份血清同样加人2个孔。另设空白对照孔2个，只加PT3S液：置37℃3
品伙伴网http：//foodmate.neGB/T 23239—2009
湿盒h。
4.3.2.4倒去血清，同上方法洗涤：甩干。将酶标记抗牛IgG挤体按工作浓度稀释后，间各孔中分别加人200u，置37℃湿盒中1h
1. 3.2. 5例去酶标记物溶液,同「:方法洗涤,甩于灿人各孔20D μI.底物溶液(参见附录C),骨37\C壶盒30mim。
4. 3.2. 6向各孔中加人50 μ 2 mol/H,SO：以终其反应。4.3.3结果判定
用酶标仪测各孔中液体光吸收值，计算间一血清2孔平均值：被检血消各孔值大于等于阴性参：考平均值2倍者为阳性血清，低了阴性参考血清2倍害为阴性，但如2孔光吸收值中有1孔低于参考阴性血清值的2倍，1孔等于或高于2倍者为可疑，烯重做。5综合判定
伊氏虫病的诊断方法有多种依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊应依靠实验缩愉奇：病原的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定：而清学方法主要用上检测世氏锥虫抗体，在群体水平:进行血清学诊断较易操作特异性强，敏感性高，但是对个体检測比较困难，有时出现非特异性反应。当在临床上怀疑有切氏锥火感粥时，可根据实际情况，由上述凡种方法中选用·种或两种宁法进行确珍。
A.1姬氏染色液的配制
姬氏染色粉0.5g：
中醇25 mL;
甘润25mL
附录A
(资料性附录)
姬氏染色液的配制与染色方法
GB/T23239—2009
将姬氏染色粉置了研中，先加少量甘油充分研磨，再加廿油继续研磨，直至用完25ml，甘油，装入棕色瓶中，用25甲醇分次洗涤剩余甘池，企部洋入棕色瓶中，塞紧瓶寨，充分探句。置65℃温箱内24 或在温小周以后过滤待用。2染色方法
用吓性蒸水或戒生理盐水按1：1释染液，用滴管将稀释染液滴于血膜1，染色20min30min。再用蒸馏水冲洗，晾于镜检。
rHklhttn://fnodmaton
GR/T23239
9—-2009
附录B
（资料性附录）
磷酸缓冲液（）
间接血凝试验用的血稀释液
.10.067mol/L磷酸氢钠液：用NazHPO，·12H.O23.71，加人重蒸水溶解，再加到1000mL，B.20.057mol/1磷酸二氢钾液：用KHzPO9.08g，加人重蒸水溶解，然后加到100UmL3坡0.067m0/磷酸氢二钠液72份，加0.067m01/1磷整二氛钾液28份再切人08%氟化钠B.3
即成PS．为长期保存可分装后商压灭菌，G
rHklhttn://fnodmatoi
（资料性附录）
酶联免疫吸附试验所需试剂溶液C.pH9.60.05moI/L碳酸盐缓冲液NaCO, 1.59 g(成 NaCO, - [0H.O 4.29 ):NaHCO3 2. 93 gF
蒸馏水加至1090mL。
2pH7.4PBS-吐温缓冲液
NeCi8g;
KCio.2 gi
吐温-200.5ml.
Na2 HPO. 2. 9 g:
蒸馏水加至1000mL。
C.3pH5.0柠檬酸盐缓冲液
0.1mol/L柠檬酸液24.3mL
0. 2 mo1/),磷酸氢二钠液 25. 7 rmL;蒸馏水至100mL，
以上各种溶液均可在0℃～10中保存10个月。底物溶液
邻米二胺10mg：
pH5.0柠檬酸盐缓冲液25ml；
溶解后再加5030%H0%。
需在临用前0.5h配制。
http：//foodmate.neGB/T 23239—2009
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。