【国家标准(GB)】 猪瘟诊断技术

IC5 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T 16551--2008
代替GB165511996
猪瘟诊断技术
Diagnostic technigues for classical swine fever (hog cholera)2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准花管理委赏会
2009-05-01实施
CB/T165512008
本标准对应于OIE最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗于册》2004版）第部分第二节2.1.13猪瘟(CSF)有关内容,且与该节标推的致性程度为非等效。本标准代臂GB16551—1996猪瘟检疫技术规范》。本标准与GB16551—1996相比主娶变化如下：本标准修订了G16551-1996第3章“群体检疫”和第4章“个体检疫”的有关内容，期除了其中有关疫苗免疫，产地检疫和查验检疫证明等《中华人民共国动物防疫法》等法律法规已有明确规定H不宜作为本标准条款的相关内容，保留和合并广雅体和个体CSF临床症状和病理变化的有关章节，单独增写了临床和病理学诊断内容；本标推将GR165511996中第5竞“实验窄检验”的内容进行了较大的修订，期除了5.1，将5.2中涉及的免体交义免疫试验、免疫姆染色试验，病毒分离与增毒试验，直接免疫费光抗体试验由原标准中附录A(补充件)和附录C(补充件)的编排格式转为本标准中的正文内容，并补充和修订了上述方法，增加了能鉴别珍断CSF白然感染和疫品免疫抗体的单抗酶联免疫吸附试验，同时，还直接引用了“随生动物诊断试验和疫声手册》（2001版）中的诊断CSF抗体的荧光抗体病毒中和试验，新增了有自主知识产权的诊断CSF病毒的反转录聚合酶链式反应本标准改变了GB165511.996的编写格式，正文采取了对CSF诊断技术分临床和病理学诊断，病原学诊断及血清学诊断三个层次诊断技术的分类编写方式，并根据所列诊断方法的性质，进行划分和归类编写；
本标谁修订了GI16551一1996中第6章“综合判定”的相关内容，并将易宁起歧义的“综合判定”一词改为“最终结论判定”，增加了与之相吻合的判定标准，使其“综合判定\与诊断结果的分析相致，删除了现行法律法规已涵盖且不适宜于本标准的第7章“检疫后处现”的有关内容：
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标滩由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人，干在时、主琴、丘惠深、赵耘。本标证所代替标的历次版本发布情况为：GB16551—1996。
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1范围
猪瘟诊断技术
GB/T 16551—2008
本标准规定了猪遮（CSF）临床诊断、病理学诊断及实验室诊断方法的技术要求。实验室诊断方法主要包括：免体互免疫试验，免疫酶染色试验病毒分离与定试验、直接免疫炎光抗体试验整光抗体病毒中和试验、猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和反转录案合酶链式反应等诊断技术。本标准适用了猪癌的诊断。免体交互免疫试验，免疫酶染色试验，置接免疫荧光抗体试验，反转录聚合酶链式反应和病持分离与鉴定试验等无种方法主要用于猪瘟病毒和抗原的诊断，以发现带毒猪和自然感染猪：猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和荧光抗体病毒中和试验主要用于猪瘟抗体的监测和免疫效果评估，其中，单抗嗨联免疫吸附试验主要用于猪寝抗体的鉴别诊断，可区别诊断猪瘟白然感染猪、免疫猪，、弱帮扰依阳性猪及猪瘟抗休阴性猪。临床及病理学诊断
：2.1·临床及病理学诊断的作用！感染CSF的猪临床症状和解剖后肉眼所见的病理变化，因病垂株致病力、感染时间和宿上等因素不同而有很大差异，问时出问还存在差无临床症状的猪瘟病毒特续性感染和多种病原混合感染的现象，因此，猪痘的临床诊断和病理学诊断只能作为综合诊断定性的依据之，不能作为确诊的根据，特别是那些隐性感染的带毒猎，一般不表现临床症状及肉眼可见的病理变化，所以，猪瘟的确诊应依赖于对CSF病毒及抗原的实验室诊断，小能形成最终的结论。2.2临床诊断.
猪群中被检猪出现下列临床症状时，可作为综合诊断定性的依据之a）体温在40.5以上或间款性的没热；b），精葵靡、倦意；畏寒，食欲不振、厌食、甚至废食，呕叫，步态不稳；：c）交替便秘与腹泻，产生带粘液和血丝的粪球，结膜充血、出血或有不正常分泌物；d）亮盘、嘴唇、耳尖下颌、四肢、腹下及腹股沟等处出现紫红色斑点或斑块；e）公猎包皮积尿或其他疑似CSF的症状；f）怀孕母猪有流产、死胎、术乃伊等现象或所产存猪有衰弱、震颤、整李、发育不度等现象，出现上述症状时，猪群作为可疑CSF对待，应全群隔离伺养，并作进一步诊断。2.3：病理学诊断
对临床检出的可疑患猪可拥样进行病理学诊断，下述肉眼可见的病变可作为综合诊断定性的依据a）。肾皮质色泽变淡，有不同大小的点状山血；b）淋巴结外观充血、切面周边出血，皇红卢相间的“大理石样”，c）脾脏不肿大，表面有点状出血或边缘出现突起的楔状梗死区：d）心脏、喉头、大题、小肠、胆囊及膀胱有点状出血：余身出血性变化、多垦片状或点状：c
“\）·回言瓣、呵肠、结肠形成“钮拍状\遗疡《慢性猪瘟）。http：/
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3病原学诊断
3.1免体交互免疫试验
3.1.1样品处理
将病猪的淋凹结、脾脏和肾脏磨萨后用无热原性的生理盐水作！：10稀释。3.1.2接种家兔
将上述处环的样品肌肉注射三只链康家兔，每只5mL，另设三贝不注射病料而仅注射生现盐水的对照兔,24 h后，每履 6 h测体温一次,连续测温,3.1.3接种兔毒
接种群品5d后对所有家免静脉注射用无热原性的生理盐水稀释感1mL含有100个免体最小感染量的猪瘟兔化弱靠（琳巴、晚解毒），低mL，同时增设谢仅洋射猪瘾绝化弱毒的对照兔。24h1,注射生理盐水和仅注射猪瘟施化弱毒的两组对照免分别2/3和后，每隔6h测体温一次，
2/2出现定型热或轻弹热
3. 1. 4定标准
猪瘟强市不引起象
以利用猪瘟统化弱革
亢猪瘟囊化弱的攻击。因此，可免传温反乓
脆是香出
试验红的诚验结果剃楚
接稍病料底
对照境
注：“一\装示多于
3.？免疫酶染色试验
霍分之二bzxZ.net
本变互免疫试验
妾种的病料中囊否含有猪瘟病森。鹰结票馨定
合疆强、男装
不昏江何糖症病考
合黏瘟化弱奇
含非猪点病热性物质
鑫猪痘龙化弱幸
3.2.1样品的采集
解剖检查时采病猪扁聘肾、淋巴结作压印片或冰冻切片，同凝设正维织对照标本。标本自然十燥后，布2%戊二醛和中等食液中固定10min.干燥后置冰箱内等检。3.2.2操作程序
3.2.2. 1将标本没人0.01%过氧秘氯或 0.01%看氮钠的TrisHC1冲液中，窄温下作用30 min。3.2.2.2用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓粒水源洗5次每医3min，风干，3.2.2.3将标本置于湿盒内，滴加1：10酶标记抗体，覆盖标本面上，37℃作用45min。3.2.2.4用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水-1%叫温缓冲液激洗5次，每次2min~3mirl3.2.2.5将标本放人DAB（4-二甲氨基偶氮苯）Tris-HCl液内，置37C作用3rnin。3.2.2.6用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水冲洗5次，每次2min~3min，再用无水酒精、二甲苯脱水,封片检查，
3.2.2.7用普适生物显微镜检查判定结果，如细胞浆染成深褐色为阳性；黄色或无色为阴性，止常对照标本应为阴性。猪癌免化弱毒接种的猪组织细胞浆呈微褐色，与强蒜株感染有明显区别：3.3病毒分离与鉴定试验
3.3.1将2g扁桃体或脾脏或肾脏剪成小块，加上灭菌钞在乳体中研成勾浆，用Hank：液或MEM配2
合品伙伴网t
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成20%器液，加青馨素（使最整浓度为500U/mL)和链素（使最终液度为500g/mL），室温下放置1h.以3000r/min离心15min取用上清液3.3.2·将PK单层细脑用胰酶消化分散后，以800r/min离心10min，用不含牛病毒性腹沔病毒（BVDV)的5%舱牛血清的MEM配成每毫升含2×10%:个细胞的总液。3.3.3北份细胞悬液（3.3.2)加份病料悬液（3.3.3)接种于带有细胞飞计的转瓶或微量细胞培养板。另设不加病料的对照若干瓶（孔），于接种后1d、2d、3d，分别从两个接种瓶（孔）和-个对照瓶（孔）中取出细胞片用Hank's液或MEM洗涤两次，每次5min，用冷无水丙酮固定10min。3.3.4按3.2或3.4.5~3.4.7进行免疫酶染色惑荧光抗体染色：镜检并判定结果。3.4直接免疫费光抗体试验
3.4.1采样
少于三彻”其中至少两例对军期患猪，活体收扇桃体或剖杀后摘取扁桃雅体检疫中，待检可疑
色结、膜脏和肾脏。个体检疫静可活保这扁桃体或剖杀可疑猪采扁体。后期病猪部杀后采扇挑梦
桃体;淋巴结脾脏和窝
3.4.2送检
采样后应尽快
3. 4. 3制片
将样品组织快
柔组织样品应新鲜且为猪瘟疫苗免疫之麗
戴检，如
出1cm
托上(组织块太
，如活作采取
切片厚度要求
接作压印片或滑
3.4.4固定
7μm。将
同时设正常
将切片、压旺散涂片置无
盐水中轻轻漂洗3款。取，
3.4.5荧光抗补潜
·将猪疯荧光藏加子样
中充分漂洗，再用
5 mol/
片表面。染色后应餐罐检，4
3.4.6镜检
将染色、封固后的
3. 4.7 判定标准
可用冰冻切片
织腐购白溶影啊结果。
直接冻贴+冰切片机的冰冻切片
包现剂或偶学浆翻包埋）：进行切片，的洁净载玻墅上，起可将样片组织百入:0.01m混/L，H17:2的磷酸缓冲30 'mita.
散由磨没入磷酸缓冲缺水
7tnn厚）封固样品
温保存解检，题也不应超过一周。實于激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显激镜下颜察。海
丁荧光显微镜视野中，城静兆体脆窝上皮细胞或肾曲小管上皮细膜聚内呈现明亮的黄绿色荧光，或肿，游巴结胞浆内有黄绿色荧光双为猪瘟病等感染作。正常对照齐细胞内应无黄绿色荧光。3. 5猪遍病毒反转录聚合酶链式反避BT-PCR)3.5.1 材料与样品准备
3.5.1.1材料准备
本试验所用试剂需用无RNA嗨污染的容器分装；各种离心管和带滤愁吸头需无RNA酶污染；前刀、镊子和研体器应经干烤灭菌。3.5.1.2样品制备
按1：5（质量浓度）比例，取待检组织和MEM液于研中充分研磨制成勾浆液；4℃，以1000g离心15tnin，敢上清液转人无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细跑培养物冻融3次备用，其他样品酌情处理：制备的样品在2℃8°心保存不应超过24h，长期保存应小分装后置70℃以下，避免反复冻融。同时设朗、阳性样品对照。3
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3.5.2RNA 提取
3.5.2.1移取750μLTrizol至1,5mLEppentlorl管，加入200μL面液（培养液或组织处现l清），旋祸搬落 20 s:案温下作用 5 min。加入 200 pμl 三氯甲烷,旋涡振荡 15 s,室温下作用10 nin,3.5.2.2以 12 000 r/rmin(11 750g),1 C离心 15 min。3.5.2.3轻轻吸取工清转至新的 1.5 mLEppendorl管（注意不娶吸到中间蛋白层).约550 μl,~600μl，加人等量预冷的异丙醇，题倒数次混匀，一20℃条件下静置至少10min。3.5.2. 4以 12 000 r/min(11 750g),4 离心 15 min.3.5.2.5轻轻倒掉E清，顺势蒋口线液在吸水纸上于（注意各管不要用吸水纸间一点），向管中轻轻加人1 tmI.预冷的75%乙醇，轻轻巅倒数次，将乙醇阈掉,将管口残液在吸水纸E干（注意各臂不要用吸水纸尚点）,盖上盖后：以50001/min,4℃离心2.mi，3.5.2.6用洁净无酶吸头将管底乙醇吸于，注意不要吸走沉淀（RNA少的情况下可能看不见沉淀）。在安全柜或超净台中将残留的Z醇吹，约5min,直垒无艺醇味为止，时间不要太长，以免RVA溶解困难。
3.5.2.7用下列比例配制溶溶解RNA：4 pL. 0. 1 mol/I. MDTT
1 μL RNA酶抑制剂(RNase inhibifor)15海水
共计20 mL,按此比例--次性配好,混勾。按每个样品 20 μL~-50 μL配制。吸取20mI~50LRNA浴解液溶腋加至Eppcndarf管底，55℃65水浴励溶1Cmin，RNA谘液在80保存。短期也可在20℃保存。3.5.3CDSA合成
3.5.3. 1啵取 2 mL 上述 RNA溶液至 PCR管+。3.5.3,2加人 1 μ1,50 pmol/1.的下游物,68 C作用 5 min,冰水浴中降温（或在PCR仪4r采用程序:68 ℃反应 5 min,置于 4 ℃结束反应）。3.5.3.3加入下列试剂：
5×篇一链缓冲铰(first strand buffer)o. F μl.0. 1 rual/I. JTI
dNTP(1o mmol/L)
O.25 μL RNA 抑制剂(RNasc inhibitur）0.5 μ反转录酶(supcrscript Ⅱ)PCR仪中50C反应60min,75%温育10min,置于4结束反应。3. 5. 4 PCR
3. 5. 4. 1
吸取上述 cDNA模板 3 mL,无酶水 31. 5 L。3. 5. 4, 2 加人下列试剂
10XPCK缓冲液
dNTP(10m mol/L)
上游引物
下游引物
2, 5 μL Tu DNA 聚合酶
将混合物吹打均勾后，至PCR仪中扩增，条件如下：94℃预热3min，94℃变性50s，58℃退火50s,72链延仲1min40s，30个循环，72℃温育10nin。置于4℃结束反应。3.5.5 nest-PCR
3.5.5.1吸取上述PCR模板1.5μL，无酶水36μL。4
品伙伴网
3.5.5.2加人下试剂，
5uL10×PCR缓冲液
dNTP(10mmol/L)
nest 上游引物
Iest下游引物
2.5μLTagDNA乐合海
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将混合物吹打均勾后，至PCR仪中扩增，条件如下，94C预热3min，94℃变性50s，54c退火50s,72℃链延伸1mini40s，30个循环，72℃温育10min，置于4℃结束反应。3.5.6电泳
取6μL.10uLPCR产物在0.8%墩脂糖避胶中进行电泳，缓冲液为0.5×TBE,100V、40min3.5.7避胺成像及结果判定
阳性样品出现1.2k大小条带、阴性样品无条带出现时，试验成立。被检测荐品出现1.2k大小条带为猪瘟阳性，否则为阴性，见图1.2.000
阴性对照：
阳性样品：
血清学诊断
4.1：荧光抗体病毒中和试验
4.1:1细胞准备
4.1.1.1将浓度为每意升含2×1o5个细胞的PK1细胞悬皴接种到下带有盖玻片的Lcighton普，培养：瓶或微壁绷胞培养板中。
4.1.1.2了37℃二氧化磁(cOz)培养箱冲培养1rl-~2d.直至有70%~~80%的细胞形成单层，Lcigh-ton管可用普通旁养箱培养。
4. 1. 2病毒中和
4.1.2.1，被检血清可了56℃灭活30min，在国际贸易中，最好作1：5稀释（终浓度1：10）。在国内作抗体水平普查时，被检血清可作1：25稀释（终浓度1：50）：4.1.2.2将稀释的血消与含有200TCiDs/0.1mL的病市悬液等体积混合，置37℃作用1h~2h。4.1.3中和后的病毒接种
4..1.3.1将带有盖玻片的Lcighton管，培养瓶或微量细胞培养板，用无血消培养液洗涤3次后，用血清-病赤巾和后的混合物接种在带有盖玻片的Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板上，置于37℃温
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箱作用1小，同时设置标难的，阻性血消中和对照，没有而清中和的病获对照和止常细胞对照。4. 1. 3. 2在 Teightan管、培养瓶或微量细胞培养板中加人细胞维持液,并将细胞培养物继续置于37℃C温箱培养2d以上：
4.1.4荧光抗体染色
4.1.4.1从Leighlou管、培养瓶或微量细脑培养板中取山带有细胞的盖玻片，用pH7.2的磷酸冲盐水洗涤细胞单层2次，欲5nit,后用无水丙酮固定l0 nin，再将工作浓度的猎瘟荧光抗体结合物滴如在带有细胞的盖玻片上,放置湿盒中，下37℃染色 30 min,并用H7.2的磷酸缓冲盐水冲洗 3次。4.1.4.2用pII值9.0~9.3的90%碳酸盐-H油缓冲液将盖玻片过断存无油的显微镜截玻片上,并在荧光显微镜下作荧光检查：
4.1.5镜检
将染色,时阅后的样品片置下激发光为蓝紫光或紫外光的光显微镜下观察。4.1.6判定标准
4.1.6.1当在荧光显微镜下，正常细胞对照和标避阳性血清中和对照的细胞胞浆中无黄绿色荧光，标雅的阴性血清和对照和没有血清中和的病萨对照的细胞胞浆中有黄绿色荧光时，试验成立，可判定被俭样品的结果巢。
4.1.6.2荧光显微镜下，被检样品的细胞胞浆内术则黄绿色荧光时,判为猪癌扰体阳性；被检粹品的细胞胞浆内有明亮的蕙绿色荧,治时,判为猪癌抗体阴性4.2猪瘟单抗酶联免疫吸附试验
4.2.1材料准备
猪瘟弱毒单抗豌化酶联抗原，猪癌强毒单抗化醉联抗原，瓣标结合物，标推阴、阳性血清，酶联板及其他必要的试验溶液，
4.2.2操作方法
4.2.2.1抗原包被
用包被羧将猪瘟弱声单抗纯化酶联抗原，猪瘟独毒单抗纯化酶联抗原分别作100倍稀释，以年孔00分别人做好标证的醛联板孔，臂湿盒放过俊。4.2.2.2洗涤
甩掉酵联板孔内的藏体，人洗涤液，案温下浸泡3mi，甩去洗涤液·再蛋新加入洗液，连续洗涤三次，最店次甩掉洗涤羧后，拍下酶联板。A.2.2.3加入被检血滑
用稀穿滋将被检血清作400倍稀释，每孔现100L：同时，将猪瘟标准阴，阳性血清以100能稀辫作对期,置凝盒于 37 °作用 1.5 -~2 h,甩掉酶联板中稀穆的血清,用洗涤液冲洗三次：洗涤方法间 4. 2. 2. 2.
4.2.2.4加入酶标抗体结台物
用蒂释液将酶标抗体结合物作 100 倍稀释,每孔加人 1C0 tL,登凝盒于 37 C孵育 1. 5 h~-2. 0 h.甩掉标抗体结合物.用洗涤液冲洗二饮，洗涤方法同4.2.2.2。4.2.2.5加底物
每孔加人新配制的底物溶液（每块96孔酶联板所器底物溶液按二胶10mg加底物缓冲液10mL加30%过氧化氨37.50uL配制）100uL，室温下观察显色反应，一日阴性对照孔略显微黄色，立即终止反应。
4.2.2.6终止反应
每孔加人终止液50μL后，迅速用嗨联诀数仪以490nm波长测定每孔的光吸收值（0D)，并以阴性血清孔作为空白对照谢零孔
4.2.3判定标准
4.2.3.1在猪瘟羽毒酶联板上：
OD20.2,为猪瘟弱毒抗体阳性；
OD<0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。4.2.3.2在猪瘟强毒酶联板上：
-OD2心5，为猪瘟强毒抗体阻性
-01)<0.5.为猪强毒抗体阴性。
4.2.4·判定结论
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4.2.4.1，同一份被检血清，当在猪瘟弱毒酶联板上，结果为阳性，而在猪瘟强毒酶联板上，结果为阴性时，表明被检猪为猎瘟疫苗免疫。4.2.4.2同一份被检血清，当在猪弱毒酶联板工，结果为阴性，但猪瘟强毒醛联板上为阳性时，表明被检猪是猎瘟强毒抗体阳性猪，该猪按8.1～3.5中任何一种试验做猪瘟抗原检查，以确定是否为带猪。
4.2.4.3一份被检血清，当在猪痘弱毒和虽荐嗨联板上，结果均为阳性时，表明被检猪为猪瘟强、弱荷抗体阳性猪，该猪应按3.1～3.5中任何一种试验做猪瘾抗原检查，以确定是否为带毒猎。4.2.4.4同~份被检清，当在猪弱毒和强麟酶联板上，结巢巧为阴性时，装明被检猪为猎瘟抗体阴性猎，该猪应按3.1~3.5中任何--种试验做猪瘟抗原检查，以确定是否为带亲的免疫麻痹猪或是真正：的猪瘟阴性猪。
最终结论判定
下列任情说之一,均可判定为CSH感染猪：a)
发病不分年龄、季节个体临床表现明显病理解病变典型，用3.1～3.5中征何一种试验确诊为CSF病靠或抗原阳性者：
临床症状和发病情说不详，群体解部检查病变典型，用3.1~-3.5中征何种试验确诊为CSF病或折原阴性旨；
发病情况、临床症状.病理变化不详、不明显或不典型，但用3.1～3.5中任何一种试验确诊为c
CSI病毒或抗原阳性者。
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