【卫生行业标准(WS)】 狂犬病诊断标准

ICS11.020
23222—2008
中华人民共和国卫生行业标准
WS281-2008
狂犬病诊断标准
Diagnostic criteria for rabies2008-02-28发布
2008-09-01实施
中华人民共和国卫生部发布
根据《中华人民共和国传染病防治法》制定本标准。WS281--2008
按照国家质检总局国家标准委公告（2005年第146号），GB17014一1997《狂犬病诊断标准及处理原则》自本标准实施之日起废止。本标准的附录A是规范性附录，附录B、附录C、附录D是资料性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、山东省疾病预防控制中心、泸州医学院附属医院、武汉生物制品研究所、中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室。本标准主要起草人：唐青、王显军、余光开、严家新、许真。建筑321---标准查询下载网

1范围
狂犬病诊断标准
本标准规定了狂犬病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对狂犬病的诊断、报告。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1狂犬病街毒streetvirus
自然状态下从感染动物或患者中发现的狂犬病病毒。2.2狂犬病实验室固定毒fixed virus狂犬病街毒株经过动物或细胞系列传代适应特定宿主后，其致病性减弱。3诊断依据
3.1流行病学史
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有被犬、猫、野生食肉动物以及食虫和吸血蝙蝠等宿主动物咬伤、抓伤、舔黏膜或未愈合伤口的感染史。
3.2临床表现
3.2.1狂躁型
狂躁型是我国最常见的类型。主要表现有：在愈合的伤口及其神经支配区有痒、痛、麻及蚁走等异常感觉，以后出现高度兴奋、恐水、怕风、阵发性咽肌控挛和交感神经兴奋症状如流涎、吐沫、多汗、心率加快、血压增高等。逐渐发生全身弛缓性瘫痪，最终因呼吸、循环衰竭而死亡。3.2.2麻痹型
麻痹型在我国较为少见。临床表现为：前驱期多为离热、头痛、呕吐及咬伤处疼痛等，无兴奋期和恐水症状，亦无咽喉挛和吞咽困难等表现。前驱期后即出现四肢无力、麻痹症状，麻痹多开始于肢体被咬处，然后呈放射状向四周延。部分或全部肌肉瘫痪，咽喉肌、声带麻痹而失音，故称“哑狂犬病”。3.3实验室检查
3.3.1直接荧光抗体法(dFA)(见A.1)或ELISA(见A.2）检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病毒抗原阳性，或用RT-PCR(见A.3）检测狂犬病病毒核酸阳性。
3.3.2细胞培养方法(见A.4)）
从患者唾液、脑脊液等标本中分离到狂犬病病毒。3.3.3脑组织检测
户检脑组织标本，用直接荧光抗体法（dFA)（见A.1)或ELISA（见A.2)检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCR(见A.3)检测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法(见A.4)分离到狂犬病病毒。4诊断原则
根据患者的流行病学史、临床表现和实验室检查结果进行综合判断，病例确诊需要实验室证据。狂犬病的病原学、流行病学和临床表现参见附录D,狂犬病特异性抗体检测参见附录B。1
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5诊断bZxz.net
5.1临床诊断病例
符合下列任一项即可诊断：
5.1.1符合3.2.1者。
5.1.2符合3.1加3.2.2者。
5.2确诊病例
临床诊断病例加3.3.1、3.3.2、3.3.3中的任何一项者。6
鉴别诊断
本病尚需与狂犬病恐怖症、破伤风、病毒性脑膜脑炎、脊髓灰质炎等鉴别，参见附录C。2
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附录A
（规范性附录）
狂犬病特异性病原学检测
A.1直接荧光抗体方法(dFA)检测狂犬病病毒抗原A.1.1原理
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感染狂犬病病毒的细胞携带狂犬病病毒抗原，狂犬病病毒抗原可以特异性与FITC标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体结合。FITC在荧光显微镜下显示可见荧光，从而使抗原抗体之间的特异性反应通过荧光显微镜可以直接观察到。直接荧光抗体方法既快速、特异文敏感，是诊断狂犬病病毒感染的首选方法。A.1.2试验材料
：A.1.2.1可用于狂犬病患者诊断的标本：受伤处皮肤组织、角膜、后颈带毛囊的皮肤组织和体液（唾液、脑脊液等)；狂犬病患者死亡后用于诊断的标本：脑组织。A.1.2.2FITC标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体。A.1.2.3常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、1：60000伊文思蓝（PBS稀释）、90%甘油(PBS配制）等。A.1.2.4荧光显微镜。
A.1.3检测步骤
A.1.3.1患者体液标本直接涂片，组织标本涂片、印片或冷冻切片。A.1.3.2室温干燥数分钟，冷丙酮室温固定7min~10min。A.1.3.3FITC标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体，按照使用说明稀释后，滴加在涂片、印片或切片上37℃湿盒孵育30min。
A.1.3.4PBS洗3次，每次5min。
A.1.3.5荧光显微镜观察结果：细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。A.1.4结果判断
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1个～4个“十”。阳性细胞数：<25%为“+”，25%～50%为“十+”，51%～75%为“十++”，>75%为“+十++”；无特异性荧光者为“”(阴性）。A.1.5意义
阳性结果，表明有狂犬病病毒感染，有确诊意义。A.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测狂犬病病毒抗原A.2.1原理
根据抗原抗体特异性结合特点，用抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体包被塑料板，与标本中待检抗原结合，其中待检抗原又与后加人的辣根过氧化物酶标记抗狂犬病病毒单克隆抗体特异性结合，再通过辣根过氧化物酶与底物作用产生可见的颜色反应，最终达到检测目的。显色程度与待检抗原含量呈正相关。
A.2.2试验材料
A.2.2.1用于检测的标本为狂犬病患者脑脊液或死亡后脑组织。A.2.2.2多株抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体混合包被的酶标板条。A.2.2.3阳性病毒对照（冻干，已灭活）。3
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A.2.2.4样品稀释液：pH7.4PBS。A.2.2.5辣根过氧化物酶标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体。A.2.2.6洗涤液：pH7.4PBS-T(PBS+0.05%吐温—20)。A.2.2.7底物液：OPD或TMB。
A.2.2.8终止液：4NH2SO4。
A.2.2.9酶标仪。
A.2.3检测步骤
A.2.3.1取待检脑组织加样品稀释液研磨制成10%脑组织悬液，或直接取待检脑脊液约0.5mL，用稀释液将待检脑悬液和阴性、阳性对照各1：20稀释（阴性对照自设，待检脑脊液不稀释），加人各自对应孔中，其中待测样品各1孔，阴性、阳性对照各2孔，100μL/孔。设2孔为空白对照，只加样品稀释液，100uL/孔，将酶标可拆板置湿盒内，37℃温育30min。剩余的阳性病毒对照保存于一20℃备用。
A.2.3.2将浓缩的洗涤液用蒸馏水30倍稀释成工作浓度，取出酶标板，甩干，将洗涤液加满各孔，倾出，甩干，重复以上操作共3次。A.2.3.3取酶结合物加人各孔（空白对照孔中不加酶结合物），100μL/孔或2滴，置湿盒内，37℃温育30min。
A.2.3.4取出酶标板、倾出液体，甩干，同上法洗板6次。A.2.3.5将显色液A/B各一滴加人各孔中，置湿盒内至阳性对照显蓝色。将终止液加入各孔，50μL/孔或1滴，终止反应。置酶标仪上读数。A.2.4结果判断
空白和阴性对照孔无色，而阳性对照孔显蓝色，则结果成立。以空白两孔的平均数调零，在酶标仪上测定450nm处各孔吸光（A)值，待测样品A值大于或等于阴性对照A平均值十0.08，即3OD阴性对照十0.08，则表明该样品为狂犬病病毒抗原阳性。A.2.5意义
检测到狂犬病病毒抗原阳性有诊断意义。A.3RT-PCR法检测狂犬病病毒核酸A.3.1原理
PCR技术是依据双链DNA分子碱基配对原则，采用耐热DNA聚合酶和DNA合成引物，以目的基因为模板在体外特异性扩增DNA片断。狂犬病病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成第一条cDNA链（RT），再进行PCR扩增，即RT-PCR。基于这一原理，设计狂犬病病毒基因片断特异性扩增引物，对狂犬病患者的标本进行狂犬病病毒特异性核酸的扩增和检测，阳性结果可以判定为狂犬病病毒感染。
A.3.2试验材料
A.3.2.1可用于狂犬病患者诊断的标本：唾液、泪液、尿液、鼻咽洗液、后颈带毛裂的皮肤组织或脑脊液等；死亡后用于诊断的标本：脑组织。A.3.2.2PCR扩增引物：以特异性扩增狂犬病病毒核蛋白(NP)基因最保守区域为目的基因片断，设计-对物：N1(+）：(587)5'-TTTGAGACTGCTCCTTTTG(605)-3；N2()：(1092)5'-CCCATATAGCATCC TAC(1013)-3。
A.3.2.3细胞总RNA分离试剂：TRIzol(用于组织标本）;TRIzolSL用于液体标本）。A.3.2.4AMV逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPMixture等。A.3.3检测步骤
A.3.3.1病毒RNA的提取：待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA，按照细胞总RNA分4
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离试剂说明提取，制备模板RNA。WS 281-2008
A.3.3.2逆转录合成cDNA：根据AMV逆转录酶反应要求，按照说明书通过逆转录反应合成与目的基因RNA序列互补的cDNA。
A.3.3.3PCR扩增：PCR循环特异性扩增目的基因cDNA，反应条件：95℃预变性5min；94℃45s、50℃50s、72℃60s，共扩增30个～35个循环；最后72℃延伸10min。A.3.3.4用1%~2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。A.3.4结果判断
如果电泳条带的分子量与预期片段大小相同，表明为狂犬病病毒N基因特异性扩增区段阳性。A.3.5意义
阳性结果表明有狂犬病病毒感染，有确诊意义。A.4细胞培养方法分离狂犬病病毒A.4.1原理
狂犬病病毒感染动物，经过在中枢神经系统繁殖后，病毒可以随神经纤维离心性散播到身体其他部位的绝大多数器官，因此狂犬病病毒适应的宿主细胞较为广泛。通过观察狂犬病病毒感染细胞后所产生的细胞病理改变，结合特异敏感的检测技术检测出病毒的存在，证明为狂犬病病毒感染。A.4.2试验材料
A.4.2.1可用于狂犬病病毒分离的标本惠者的睡液、脑脊液或皮肤组织等；死亡后用于病毒分离的标本：脑组织。A.4.2.2细胞系
鼠神经瘤细胞、BHK细胞、Vero细胞等。A.4.2.3细胞培养基成分
Eagle's培养液、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、胎牛或小牛血清、7.5%碳酸氢钠。A.4.2.4BHK或Vero细胞培养基
a）生长液：100mLEagle's生长液中包含Eagle's液84mL、胎牛或小牛血清10mL、青霉素/链霉素2mL、1%谷氨酰胺1mL，用7.5%碳酸氢钠调pH值至7.2~7.4。b）维持液：100mLEagle's维持液中包含Eagle's液92mL、胎牛或小牛血清2mL、青霉素/链霉素2mL、1%谷氨酰胺1mL，用7.5%碳酸氢钠调pH值至7.2~7.4。A.4.2.5培养条件
37℃5%CO2培养箱中培养。
A.4.3实验步骤
脑脊液可直接接种细胞，以BHK细胞为例：A.4.3.1培养单层细胞至80%汇合度：A.4.3.2弃去培养液，加人0.2mL液体标本或组织悬液，37℃孵箱吸附1h；A.4.3.31h后，补加维持液，置于37℃5%CO2培养箱中培养；A.4.3.4培养至第4天～第5天，刮取细胞涂在载玻片上，室温干燥后丙酮固定，按免疫荧光法进行鉴定；
A.4.3.5阴性者需要继续盲传3代：将细胞培养瓶反复冻融3次，4℃，12000r/min，离心15min后取上清液，按照上述方法在细胞内连续传代3次。A.4.4结果判定
细胞传代出现病变，免疫荧光法检测病毒抗原阳性。A.4.5意义
阳性结果表明有狂犬病病毒感染，有确诊意义。5
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附录B
（资料性附录）
狂犬病特异性抗体检测
在自然感染情况下，狂犬病病毒通常在被疯动物咬伤时通过其带有病毒的睡液进人机体伤口内，在入侵部位，狂犬病病毒基本上不增殖，一般也不侵入血流，故不能形成病毒血症。因此，在感染后的一段时间内狂犬病病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触，不能有效刺激机体产生抗狂犬病病毒感染的免疫应答反应。狂犬病的晚期因血脑屏障作用被破坏，脑内大量病毒抗原得以进入血流，可以刺激机体的免疫系统产生大量特异性抗体。因此，许多狂犬病患者在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，狂犬病特异性抗体只在临床疾病的晚期出现。因此，检测到狂犬病病毒特异性抗体对诊断有参考意义。
快速荧光灶抑制试验(RFFIT)测定血清的中和抗体滴度B.1.1试验材料
B.1.1.1用于检测的标本为狂犬病患者血清。BHK21/BSR细胞。
B. 1. 1.21
攻击病毒CVS株（ATCCVR959）。B.1.1.32
96孔平底组织培养板。
B.1.1.5已知滴度的参考血清。
细胞培养基：D-MEM，pH7.0，补加10%灭活的胎牛血清（FCS），0.3mg/mL谷氨酰胺，B.1.1.6
0.03mg/mL庆大舞素。
B. 1. 1.7 PBS。
80%丙酮（水20%），一20℃保存。B.1.1.88
FITC标记的抗狂犬病病毒NP抗体结合物。B.1.1.91
可调自动吸管（带一次性吸管头）。B.1.1.10
B.1.1.1156℃水浴，37℃CO2恒湿孵箱。B.1.1.12荧光显微镜。
B.1.2检测步骤
B.1.2.1攻击病毒的制备和滴定
B.1.2.1.1通常采用的毒株为固定的狂犬病病毒CVS株，在BHK/BSR细胞中制备。细胞上清分装安，储存于一80℃。B.1.2.1.2
B.1.2.1.3最适攻击剂量为24h温育后能使80%的细胞感染（产生荧光包涵体）的最高病毒稀释度。B.1.2.2血清病毒中和反应
B.1.2.2.1待检血清经56℃30min灭活。B.1.2.2.2在96孔板上设置“未感染细胞对照”和“病毒对照”孔。B.1.2.2.3每个血清稀释度设2个孔。B.1.2.2.4除病毒对照孔外，每个孔加人100μLD-MEM培养基。B.1.2.2.5直接在孔中进行待检血清和参考血清的系列3倍稀释：（每孔已加人100μL培养基）将50μL血清加人第一排孔，依次从1/3到1/81稀释。在“病毒对照”孔，加人100μL培养基。B.1.2.2.6在含稀释血清的每个孔内，加入150uL预先滴定的病毒悬液。在“未感染细胞对照”孔内，加人50μL培养基。6
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在“病毒对照孔”，对病毒悬液进行4次2倍稀释，从1/2到1/16。B.1.2.2.7在37℃5%CO2恒湿孵温箱中保温1h。B.1.2.3加入细胞
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B.1.2.3.1用胰酶消化细胞，制备浓度为1×106细胞/mL的细胞悬液，每孔加入50μL细胞悬液（5×104细胞）。
B.1.2.3.2在37℃5%CO2恒湿孵箱中，温育24h。B.1.2.4固定和染色
B.1.2.4.1用与盛有漂白粉溶液的大瓶相连的真空装置抽吸去各孔中的上清液。B.1.2.4.2用PBS浸泡各孔3次，每次5min（抽吸）。B.1.2.4.3以80%丙酮浸洗各孔，重复一次（在一20℃放置5min）。抽干各孔，空气干燥。B.1.2.4.4每孔加人20μL40μL抗NP抗体荧光结合物（预先1：20稀释），在37℃湿盒中保温30min。
吸出结合物，以PBS洗2次，各为1min和5min。B.1.2.4.5
B.1.2.4.6空气干燥，每孔加1滴甘油。B.1.2.4.7荧光显微镜下观察。
B.1.3结果判断
B.1.3.1记录每孔的荧光数(FF)。B.1.3.2与病毒对照组比较，对每种待测血清计算FF数减少50%的稀释度。B.1.3.3与参考血清比较，计算每种待测血清的中和抗体滴度。B.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测狂犬病病毒抗体B.2.1试验材料
B.2.1.1用于检测的标本为狂犬病患者血清。B.2.1.2狂犬病病毒抗原包被的酶标板条。3阴性对照血清。
已知滴度的阳性对照血清。
样品稀释液：pH7.4PBS(含5%脱脂奶）。辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。洗涤液pH7.4PBS-T(0.05%吐温—20）。显色液：A/B液。
B.2.1.9终止液：4NH2SO4。
B.2.1.10酶标仪
B.2.2检测步骤
B.2.2.1用样品稀释液将待测样品按1：50稀释，加人各自对应孔中，其中待测样品各1孔，100μL/孔。空白对照及阴性对照各2孔，100μL/孔。取自设阳性对照，用样品稀释液稀释至工作浓度，再依次倍比稀释至1：1600，每个稀释度各加一孔，100uL/孔，将酶标可拆板置湿盒内，37℃温育30min。B.2.2.2取出酶标板，倾出液体，甩干，将洗涤液加满各孔，倾出，甩干，重复洗板4次。B.2.2.3取酶结合物加人各孔，100μL/孔或2滴，置湿盒内，37℃温育30min。B.2.2.4取出酶标板、倾出液体，甩干，同上法洗板6次。B.2.2.5将显色液A/B液各一滴加人各孔中，置湿盒内37℃显色15min，加终止液一滴，置酶标仪上读数。
B.2.3结果判断
空白和阴性对照孔无色，而阳性对照孔显蓝色，则结果成立。7
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在酶标仪上测定450nm处各孔A值。以IU/mL的对数为横坐标，以各孔A值对数为纵坐标，将阳性对照各孔依次在对数坐标纸上标出相应位点，各位点应形成一条直线，在该直线上找出样品A值的对数，其横坐标所示即为该样品相应的IU/mL的对数。B.2.4意义
接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/mL，表明已获得保护。未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/mL，且近期有4倍增高，可考虑为狂犬病。部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。
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C.1狂犬病恐怖症
附录C
（资料性附录）
狂犬病的鉴别诊断
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狂犬病恐怖症（rabies phobia）国外称症性假性狂犬病（hysterical pseudo-rabies）、狂犬病瘾症（rabieshysteria）、狂犬病样恐水（lyssaphobia）及恐水性恐怖症（hydrophobia）。由于狂犬病是一种非常恐怖的疾病，一些瘾病患者在暴露后想象自已患有此病。通过暗示，他们常有较为悲观的表现，如攻击行为、咬人、吼叫甚至恐水。假性恐水是一种夸张的表现，不能准确地产生反射特点，缺乏发热，特殊的前驱症状和特异性的实验室检查结果。患者的病情不再发展，甚至可自行恢复。在这些病例中，被动物咬伤至出现临床症状仅几小时或1d2d，而狂犬病的潜伏期不可能这样短，了解患者以前的个性有助于诊断。
C.2破伤风
破伤风（tetanus)的早期症状是牙关紧闭（lockjaw），以后出现苦笑面容及角弓反张。破伤风患者试图吞咽可引起痛苦的肌痉挛，但不恐水。一种罕见的局限性破伤风，即仅仅累及支配吞咽肌群的颈神经所致的恐水性破伤风(hydrophobictetanus），在临床上易与狂犬病混淆。破伤风受累的肌群在痉挛的间歇期仍保持较高的肌张力，而狂犬病患者的这些肌群在间歇期却是完全松弛的。破伤风通过现代的精心治疗，多半能够恢复。
C.3病毒性脑膜脑炎
有明显的颅内高压和脑膜刺激征，早期可出现意识障碍，常见的病原体有乙脑病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒。除了狂犬病脑炎外，这些病毒中任何一种脑部感染都不会引起恐水表现。
C.4脊髓灰质炎
脊髓灰质炎（poliomyelitis）通过免疫预防，目前发病已经很少。麻痹型脊髓灰质炎（paralyticpolio-myelitis)易与麻痹型狂犬病混淆。此病起病时可出现双向热型，双侧肢体出现不对称弛缓性瘫痪外，常常伴有感觉过敏，脑脊液呈细胞蛋白分离现象，其分类以多形核粒细胞为主，而狂犬病的整个病程中以淋巴细胞为主。更主要的是可自脑脊液、咽部和大便中分离出脊髓灰质炎病毒。补体结合抗体阳性，特异性IgM抗体阳性均可作出确诊。9