【国家标准(GB)】 化学品 快速生物降解性 改进的OECD筛选试验

ICS13.300;13.020.40
中华人民共和国国家标准　
GB/T21857--2008
化学品
快速生物降解性
改进的OECD筛选试验
Chemicals-Ready biodegradability--Modified OECD scrcening test2008-05-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-09-01实施
GB/T21857—2008
本标准等同采用经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.301E（1992年）《改进的OECD筛选试验》（英文版）。
本标准做了下列编辑性修改：
将计量单位改为我国法定计量单位。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位：环境保护部化学品登记中心。本标准参加起草单位：沈阳化工研究院安全评价中心、上海市环境科学研究院、环境保护部南京环境科学研究所。
本标准主要起草人：周红、聂晶磊、刘纯新、蔡磊明、赵玉艳、沈根祥、刘济宁。1
1范围
化学品快速生物降解性
改进的OECD筛选试验
GB/T21857—2008
本标准规定了化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验的方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本标准适用于测试非挥发、水中溶解度不低于100mg/L的化学品的快速生物降解性。术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
快速生物降解性
readybiodegradability
受试物在限定时间内与接种物接触表现出的生物降解能力。2.2
primarybiodegradation
初级生物降解
受试物在生物作用下化学结构发生变化致使特性丧失的过程。2.3
dissolvedorganiccarbon,DOC
溶解性有机碳
溶液中有机碳的含量，常指通过0.45μm滤膜过滤后液体中的有机碳含龄，或经4000r/min转速离心15min后上清液中的有机碳含量。2.4
月lagphase
停滞期
试验开始到降解率达到10%的时期。2.5
月10-dwindow
十天观察期
生物降解率达到10%之后的10d试验时间。2.6
degradationphase
降解期
停滞期结束到降解率达到最大降解率的90%的时期。受试物信息
分子式和结构式；
水中溶解度；
蒸气压；
碳含量；
纯度；
主要成分组成比例；
吸附性；
微生物毒性。
4方法简介
4.1原理
GB/T21857—2008
在一定体积的无机培养基中加人已知浓度的受试物（10mg/L～40mg/L，以DOC计），作为唯一有机碳源，每升培养基接种0.5mL污水处理厂二级出水的滤液。在温度为22℃士2℃、黑暗或散射光的条件下进行曝气。在28d内，定期测定DOC以确定降解率。生物降解率用DOC去除浓度（用接种物的空白对照试验校正)计算，以初始浓度的百分比表达。可以通过特定化学分析测定试验开始和结束时受试物的浓度，确定受试物的初级生物降解性。4.2参比物
本标准推荐苯胺（新蒸馏）、醋酸钠或苯甲酸钠作为参比物。若使用其他参比物，试验报告中应加以说明。
5试验准备
5.1·设备
锥形瓶，250mL+2L
震荡器；
配有合适滤膜的过滤器；
DOC测定仪究
溶解氧测定仪；
）离心机。
5.2接种物
5.2.1接种物的燃拥
接种物可以采脏要处理生活污水的水处理广或中试规模的污水处理装置的二级出水。5.2.2接种物的难备
从主要处理组活污水的污水处理厂或中试规模的污水处理装置的曝气池采集二级出水，在运输过程中保持有氧状态。沉淀1h或用粗滤纸这滤，保持上清液或滤出液在有氧状态直到使用。5.2.3接种物的预处理
如有需要，在试验温度下，将接种物预处理到符合试验条件，但不是对接种物进行预驯化。预处理包括在试验温度下对（在试验培养基中的)活性污泥或对二级出水曝气培养5～76。5.3试验用水
使用去除性物质（如2+）的高纯度去离子水或蒸馏水，并且有机碳含最不得高于受试物浓度的10%。对于每组系列试验使用同一批水。5.4培养基
5.4.1试验培养基备液
用分析纯试剂制备下列贮备液
磷酸缓冲液：称取8.50g磷酸二氢钾（KH2PO.）、21.75g磷酸氢二钾（K2HPO4）、33.40g二a)
水合磷酸氢二钠(Na2HPO，·2H2O)和0.5g氯化铵（NHCI)，用水溶解，定容至1L，pH值为7.4。
氯化钙溶液：称取27.50g无水氯化钙（CaCl2）或36.40g二水合氯化钙（CaCl2·2H2O)，用水溶解，定容至1L。
硫酸镁溶液：称取22.50g七水合硫酸镁（MgSO.·7H2O)，用水溶解，定容至1L。c)
d）氯化铁溶液：称取0.25g六水合氮化铁(FeCls·6H2O)，用水溶解，定容至1L。上述贮备液加人0.05mL浓盐酸或0.4g/LEDTA二钠盐缓冲溶液保存。如果贮备液中出现沉淀，则需重新配制。
e）微量元素溶液：称取39.9mg四水合硫酸锰（MnSO4·4H2O）、57.2mg硼酸（HsBOs）、42.8mg七水合硫酸锌（ZnSO·7H2O）、34.7mg钼酸铵（（NH4）sMozO24）、100.0mg铁-警2
合物（FeCl3·EDTA)用蒸馏水溶解，定容至1L。GB/T21857—2008
f）维生素溶液：称取15.0mg酵母育溶于100mL蒸馏水中，用0.2μm孔径滤膜过滤除菌，或现用现配制成新鲜的溶液。
5.4.2试验培养基的制备
在800mL蒸馏水中加入磷酸缓冲液10mL，再分别加人氮化钙溶液、硫酸镁溶液、氯化铁溶液、微量元素溶液、维生素溶液各1mL，用蒸馏水定容至1L，6试验程序
6.1组别设计
a）通常，试验中需要设置下列组别：一含受试物和接种物的试验组（两个锥形瓶平行）：一仅含接种物的接种物空白对照组（两个锥形瓶平行）；—一含参比物和接种物的程序对照组。b）必要时：
一含受试物和消毒剂的无菌对照组一含受试物、接种物和消剂的吸附对照组；一含受试物、参比物和接种物的毒性对照组（见附录A）。6.2受试物贮备液
受试物或参比物的水中溶解度若超过1g/L，则称取1g～10g，用去离子水溶解并定容至1L。否则，将受试物直接加人试验培养基中，确保受试物溶液均质化，或按附录B所述处理受试物，6.3试验操作
6.3.1锥形瓶的准备
以2L锥形瓶装1L悬浮液为例，锥形瓶中先装人800mL试验培养基，再分别加人受试物或参比物的贮备液，使锥形瓶中DOC的质量浓度为10mg/L～40mg/L，调节pH值至7.4。按照每升试验培养基使用0.5mL接种物滤出液的比例将接种物接种进锥形瓶中，用试验培养基定容至1L。同样用试验培养基配制空白对照组，但只加接种物，不加受试物或参比物。用试验培养基接种一瓶同时含有受试物和参比物的程序对照组检查受试物对接种物的抑制作用。用经灭菌的未接种的受试物溶液（无菌对照组）检查受试物是否发生非生物降解。可采用滤膜(0.2μm～0.45μm)过滤或加人适当的有毒物质来抑制微生物活性。另外，可采用一个含有受试物、接种物和消毒剂的吸附对照组检验受试物在污泥、容器壁上的吸附性，评价受试物的吸附程度。
混合之后，从每个锥形瓶取样测定其初始DOC浓度（附录C）。用铝箱将锥形瓶口溢住，并确保锥形瓶中试验药液和外界空气能自由交换，将锥形瓶置人荡器中培养。6.3.2取样和DOC测定
整个试验期间定期从每个锥形瓶中取样测定DOC浓度（两个平行）。必须连续测定试验恩浮液和接种物空白平行试验的DOC。每次测定DOC时，试验悬浮液的取样量以满足试验测定的最小量为宜。在取样之前应向锥形瓶中加人适量的水以补充蒸发掉的水分。取样前将培养基充分混合并确保在取样前粘附在容器壁上的物质再次溶解或悬浮。取出的样品应立即用滤膜过滤或离心分离。取样当天对过滤或分离的样品进行测定。否则在2℃～4℃最多保持48h或在一18℃以下长期保存。6.3.3取样频率
取样频率要保证取得足够的样品，从而可以评估十天观察期内DOC的去除百分率。取样的模式无法精确描述。如果在取样的当天进行测定，可根据测定结果确定下次的取样时间。如果将样品保存后再测定，则每天取1次或每两天取1次样品，先测定最后的样品（第28天的），用逐步倒退法选择测定3
GB/T21857—2008
其他样品，这样用相对较小的样品数目可能获得一个很好的生物降解曲线。如果最后的样品（第28天的)没有明显降解，其他样品无需再进行测定。7质量保证与质量控制
a）在稳定期、试验结束时或十天观察期结束时，平行试验间的降解率最大差别应低于20%。b）试验进行到14d时，参比物程序对照的降解率（以DOC计)不小于70%。8数据与报告
8.1数据处理
8.1.1测定数据记录和处理
将试验数据填写在数据记录表中(附录D)。8.1.2生物降解百分率计算
用DOC测定平均做计算矫次取样时两个试验组的降解率(D,）。见式(1)：D
式中：
t时刻的降解百分率，%
GfChlon
+Cbl(o)
含受试物和胺种物的试验组的初始DOC平均浓度，单位为毫克每升(mg/L)；Co
C,-含受试物剂接种物的试验组：时刻的DOC平均浓度.单位为毫克每升（mg/L)；Chl（1）
用两个试验继的平均值，绘图表示降解过程，如果试验符合有效性标准，指出十天观察期。计算和报告在稳定期、试验缩肃和在十天观察期结束时的DOC去除百分率。当有无菌对照时用试(2)计算非生物降解百分率，D
式中：
D非生物降解百分率%
2×100
Cs(o)-.--无菌对照组的初始DOC浓度，单位为毫克每升（mg/L)；Cs()-----无菌对照组t时刻的boC浓度，单位为毫克每升（mg/L)8.1.3初级生物降解百分率计算
当可获得受试物的特定化学分析数据时，可按照式(3)计算初级生物降解百分率。D. -Ss= Sr × 100
式中：
D,--t时刻(试验结束时通常为28d)的初级生物降解百分率，%；Sa-试验结束时试验组中受试物的残留量，单位为毫克每升(mg/L)；Sb---试验结束时无菌对照组中受试物的残留量，单位为毫克每升(mg/L)。8.2结果报告
试验报告应包括以下内容：
a）受试物：
物理属性，及基本理化性质；
受试物鉴别数据。
（2）
·（3）
b）试验条件：
接种物：状态和取样地点，浓度和预处理方式；一污水中工业废水的比例和状况(若已知)；一试验周期与温度；
一如果受试物是非常难溶的物质，提供受试物溶液/悬浮液制备方法；程序改变的原因及解释说明。
c）结果：
一将数据填人“数据记录表”，任何观察到的抑制现象；
任何观察到的非生物降解；此内容来自标准下载网
受试物质特定化学分析数据（如果有)；受试物降解产物的分析数据（如果有）；GB/T21857—2008
受试物级参比物的降解曲线：包括停滞期：降解期和十天观察期和斜率；一稳定期、试验结束时和(或）十天观察期结束时的降解百分率d）结果讨论
GB/T21857-2008
附录A
(资料性附录）
受试物对接种物生长抑制作用的处理A.1受试物对接种物生长抑制作用的处理当快速生物降解试验中受试物表现为无生物降解性时，为判别是源于受试物对接种物的抑制作用还是困为受试物的惰性，推荐采用以下措施：微生物渐性试验和生物降解试验采用类似或相同的接种物。微生物球性试验可以单独或联合采用以下方法：活性污泥呼吸抑制试验、BOD和(或）微生物生长抑制试验。
生物降解性试验中，为避免受试物抑制接种物的活性，建议受试物浓度设置为ECso的1/10(或低于EC20）。若受试物对接种物EC50大于300mg/L时，可判定受试物对接种物无抑制影响。当受试物对接种物EC5o低于20mg/L时，应设置较低的受试物浓度。推荐采用密闭瓶法试验或使用14C标记材料评价生物降解性；若采用经受试物驯化的接种物，试验时可设置较高的受试物浓度，但试验结果不能用于评价快速生物降解性。o
附录B
（资料性附录）
难溶性受试物的处理
对于难溶于水的受试物的生物降解性试验，应特别注意以下问题：GB/T21857—2008
鉴于均质的液体很少有采样问题，因此应采用适当的方法使固体物质均质化，避免非均质造成的误差。当需要从混合物或含大量杂质的受试物中采集几旁克的代表样品时，尤其应特别小心。试验过程中可采用多种搅拌方式，要注意搅拌到足以使受试物分散、但又不致于出现过热、泡沫过多或过强的分散力。
可使用乳化剂使受试物品稳定的分散状态，但乳化剂在试验条件下应对接种物无毒、不降解，也不起泡。
对溶剂的要求同乳化剂
对于固体受试物，乳化剂不得属于固体裁运剂，但油性受试物可以使用载运剂，当使用辅助物质如乳化剂、溶剂和裁运剂时，应设置辅助物质空白对照?
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C.1溶解性有机碳(DOC)
附录C
（资料性附录）
有关参数的计算和确定
根据定义，溶解性有机碳是指任何化合物或混合物中溶于水并能通过0.45μm滤膜的有机碳。从试验容器中取出样品后立即用适当的过滤器和滤膜过滤，舍去最初的滤出液20mL（当使用小过滤器时，此恶可相应减少)，保留10mL～20mL（取决于分析需要的体积)供有机碳分析，用有机碳分析仪测定DOC浓度，有机碳分析仪必须能够精确测量相当于或低于在试验所用的起始DOC浓度的10%的量。
在同一工作日内不能测定滤液样品时，可在冰箱中4℃下保存样品，但保存时间不得超过48h，在一18℃可保存较长时间。
法：滤膜表面通常涂有亲水性涂层物质，这样，过滤器就可能含有溶解性有机碳，影响生物降解性的测定。将过滤器放入去离子水中煮沸3次、每次1h，可去除涂层物质和溶解性有机物，其后过滤器可在去离子水中保存一期。如果使用一次性的过滤器，则每批都应检查确保其不释放出溶解性有机碳。同时确保受试物不被过滤器吸附。
在离心力4000g（约为40000m/s2）下离心15min可代替过滤，由于不是全部的细菌都能去除，或者细菌体的部分有机碳会再溶解，该方法不适用于分析DOC初始浓度低于10mg/L的样品。8
D.1试验室
试验的开始日期
受试物
名称：
受试物储备液浓度：
附录D
（资料性附录）
改进的OECD筛选试验数据记录表mg/L(以化学物质的质量计）
受试物在试验培养基中的初始浓度，Co：D.4接种物
污水的来源：
预处理：
前期调节，如有：
在反应混合物中的浓度：mg/L
5碳的测定
mg/L(以化学物质的质量计）
碳分析
碳分析仪：
含受试物和接
种物的试验组
仅含接种物的
空白对照组
平均值Caca）
平均值Cbca
平均值Cen
平均值Caca
Ce+Caa
平均值Chlc=
GB/T21857—2008
n天后的DOC值/(mg/L)
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