【地方标准】 猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术

山东省地方标准 DB37/T1827-2011《猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术》于2011年4月8日发布，2011年6月1日实施。本标准由山东省农业科学院提出，山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口，山东省农业科学院畜牧兽医研究所起草。 本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则》起草，规定了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光PCR检测技术要求，适用于猪血清和组织中PCV2的检测。 1. 范围：本标准适用于猪圆环病毒2型的检测，具体要求包括试剂、器材及方法等。 2. 材料： 2.1 器材：微量移液器（最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL），高速冷冻离心机，紫外分光光度计，PCR仪。 2.2 荧光定量PCR试剂：质粒提取试剂盒，SYBR Green I核酸染料，凝胶回收试剂盒，蛋白酶K，SDS液，乙醇，琼脂糖凝胶，DNA Marker等。 3. 方法： 3.1 质粒标准阳性模板的制备：通过普通PCR技术扩增PCV2的ORF2基因702bp片段，并构建质粒。使用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，并计算标准品的拷贝数。 3.2 病料基因组提取：使用蛋白酶K裂解法提取病料的总DNA。 3.3 荧光定量PCR体系：反应体系包括SYBR Green核酸染料，引物Y1、Y2，DNA，超纯水等。荧光定量PCR程序的设定，包括温度、时间及步骤。 4. 标准曲线：使用不同浓度梯度的质粒模板，制作标准曲线。建立的标准曲线斜率为-3.304，相关系数为0.994。 本标准的附录A为规范性附录，详细列出了实验所需的各种试剂和操作步骤。