【地方标准】 猪乙型脑炎病毒RT-PRC检测方法

DB41/T1515—2017 猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法
发布单位：河南省质量技术监督局
发布日期：2018-03-06
前言：本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草，由河南省畜牧局归口。本标准起草单位包括河南省动物疫病预防控制中心、郑州市畜牧技术推广站、焦作市动物疫病预防控制中心、驻马店市动物疫病预防控制中心、开封市动物卫生监督所、郑州市中心医院。本标准主要起草人：崔沛、班付国、闫若潜、曹伟伟、马震原、陈悦、王淑娟；参加起草人：王英华、谢彩华、王翠、王华俊、赵胜杰、赵明军、王东方、郭育培、张敏、杨晴、张煜、刘先敏、靳冬、刘淑敏。

1 范围
本标准规定了猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测的试剂和仪器设备，样品采集、处理、存放及运输，操作方法和结果判定。适用于对疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、血液、精液、流产胎儿、死胎、木乃伊胎等样品中病毒核酸的检测。

2 试剂和仪器设备
2.1 试剂
2.1.1 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂应使用无RNA酶污染的容器进行分装。
2.1.2 组织悬液 -20℃保存。
2.1.3 裂解液（TriZol）、氯仿、1X核酸电泳缓冲液、0.01mol/L（pH7.2）PBS、DEPC处理水，4℃保存。
2.1.4 组织样品悬液常规试剂常温保存。
2.1.5 裂解液、氯仿、0.01mol/L PBS、DEPC水均应2℃-8℃保存。
2.1.6 异丙醇、75%乙醇，应-20℃保存。
2.1.7 阳性对照样品、阴性对照样品见附录A。
2.1.8 RT-PCR扩增用上、下游引物序列见附录B。
2.1.9 猪乙型脑炎病毒RT-PCR试验反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。

2.2 仪器设备
PCR扩增仪、高速冷冻离心机（≥12000 r/min）、核酸电泳仪及水平电泳槽、恒温水浴锅、生物安全柜、组织匀浆器、2℃～8℃冰箱、-70℃冰箱、单道微量移液器（0.1μL～2.5μL、0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）、凝胶成像系统或紫外透射仪、真空干燥器。

3 样品的采集、处理、存放及运输
3.1 样品的采集
采集疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎及公猪精液等靶组织样品，装入灭菌1.5 mL离心管中编号，送实验室。

3.2 样品的处理
3.2.1 组织样品处理：取100 mg待检样品，按1:5倍体积加入PBS，在研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000 r/min离心15 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。
3.2.2 血清样品处理：用无菌注射器自耳静脉采集血液1-2 mL，血清析出后直接转入新的无菌1.5 mL离心管中编号备用。

3.3 存放与运输
采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰尽快运送到实验室。样品在2℃～8℃条件下保存不超过24小时；若超过24小时，应放置于低于-20℃冰箱，不宜反复冻融。

4 操作方法
4.1 样品RNA的制备
4.1.1 取1.5 mL灭菌离心管，每管加入300 μL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各100 μL，吸头反复吸打混匀，每份样品使用独立吸头，再加入100 μL氯仿，充分颠倒混匀，于4℃条件下12000 r/min离心15 min。
4.1.2 吸取离心后的上清液150 μL转移至新的1.5 mL灭菌离心管中，加入150 μL 预冷至-20℃的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15 min。
4.1.3 4℃条件下12000 r/min离心15 min，轻轻倒去上清，将离心管倒置于吸水纸上吸干液体。加入1 mL 75%乙醇轻轻颠倒洗涤。
4.1.4 4℃条件下12000 r/min离心5 min，轻轻倒去上清液，将离心管倒置于吸水纸上吸干液体。
4.1.5 4℃条件下12000 r/min离心30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器吸干，样品使用独立吸头，避免触及沉淀，真空抽干3-5 min或室温干燥10 min，不宜过干，以免RNA溶解困难。
4.1.6 加入1 μL DEPC处理水，进行后续操作。