【地方标准】 饲料添加剂植酸酶产品质量评价规程 体外法

DB37/T3994—2020
饲料添加剂植酸酶产品质量评价规程 体外法
Technical specification for the evaluation of phytase feed additive products - in vitro method

前言
本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：林海、焦洪超、赵景鹏、王晓鹃。

1 范围
本标准规定了通过体外法进行饲料添加剂植酸酶产品质量的评价方法。本标准适用于固体饲料添加剂植酸酶产品质量进行同批次对比评定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 601 化学试剂 标准滴定溶液的制备
GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用试剂及制品的制备
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 17890 饲料用玉米
GB/T 20195 动物饲料试样的制备

3 原理
以玉米为底物，定量添加饲料添加剂植酸酶产品，通过体外胃蛋白酶-胰蛋白酶体系模拟畜禽消化过程，底物释放的磷能与偏钒酸铵生成黄色的复合物，于 400 nm 波长下进行比色测定，以单位质量植酸酶产品能释放的植酸量确定饲料添加剂植酸酶产品的质量。

4 试剂或材料
本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 中规定的三级水。试验中所有标准滴定溶液、试剂及制品，在没有注明其他要求时，均按 GB/T 601、GB/T 603 的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。
4.1 胃蛋白酶：≥250 U/mg。
4.2 胰蛋白酶：≥600 U/mg。
4.3 浓盐酸。
4.4 盐酸溶液 (0.01 mol/L)：pH 2.0，取 0.31 mL 盐酸，注入 1000 mL 蒸馏水。
4.5 磷酸缓冲溶液 (0.1 mol/L)：pH 7.6，31.2634 g Na2HPO4·12H2O 和 20.8634 g NaH2PO4·H2O 分别溶解、混合，加水稀释至 1000 mL。
4.6 胃蛋白酶溶液 (1.0 mg/mL)：0.1 g 胃蛋白酶 (4.1)，溶解于 100 mL 0.01 mol/L 盐酸溶液 (4.4) 中，pH 2.0。
4.7 胰蛋白酶溶液 (2.5 mg/mL)：0.25 g 胰酶 (4.2)，溶解于 100 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲溶液 (4.5) 中，使用前半小时配制。
4.8 氢氧化钠溶液 (1.0 mol/L)：4 g NaOH，溶解于 100 mL 蒸馏水中。
4.9 Tris-HCl 缓冲液：pH 7.6。
4.10 磷标准储备液 (50 μg/mL)：取 105 ℃ 干燥至恒重的磷酸二氢钾，准确称取 0.2195 g，溶解于水，移入 1000 mL 容量瓶中，加硝酸 3 mL，加水稀释至刻度，摇匀，即得。置聚乙烯瓶中 4 ℃ 下可储存 1 个月。
4.11 钒钼酸铵显色剂：称取偏钒酸铵 1.25 g，加水 200 mL 加热溶解，冷却后再加入 250 mL 硝酸；另称取钼酸铵 25 g，加水 400 mL 加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水稀释至 1000 mL，避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用。
4.12 透析袋：截留分子量 12000～14000 Da，使用前以蒸馏水煮沸 10 min，清洗干净，于 4 ℃ 蒸馏水中浸泡存放，90 天内可用。

5 仪器设备
5.1 分析天平：感量 0.0001 g。
5.2 高速粉碎机：转速不低于 24000 rpm。
5.3 鼓风干燥箱：RT+10 ℃～200 ℃，精度 ±0.5 ℃。
5.4 水浴恒温振荡器：RT+5 ℃～100 ℃，精度 ±0.5 ℃。
5.5 紫外-可见分光光度计：带 1 cm 光径比色皿。
5.6 酸度计：pH 精确至 0.01。
5.7 高温电炉。

6 样品
6.1 饲料添加剂植酸酶
按 GB/T 14699.1 的规定进行采样，选取有代表性的样品，用四分法将试样缩分至 100 g，按照 GB/T 20195 制备样品，密封、避光、25 ℃ 以下处保存。
6.2 玉米
6.2.1 空白玉米
用作底物的玉米应符合 GB/T 17890 级饲料用玉米的要求。将玉米样品 105 ℃ 烘至恒重，回潮，粉碎，过 60 目筛，密封保存。
6.2.2 添加植酸酶玉米
取 6.2.1 制备好的空白玉米试样，每千克添加 0.2 g 饲料添加剂植酸酶产品，充分混匀，密封保存。

7 试验步骤
7.1 标准工作曲线绘制
准确移取磷标准储备液 (4.10) 0 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、15 mL 于 50 mL 容量瓶中（即相当于含磷量为 0 μg、50 μg、100 μg、250 μg、500 μg、750 μg），于各容量瓶中分别加入钒钼酸铵显色剂 (4.11) 10 mL，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置 10 min 以上，以 0 mL 磷标准溶液为参照，用 1 cm 光径比色皿，于 400 nm 波长下测定各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线或计算回归方程。
7.2 试样测定
7.2.1 准确称取添加植酸酶玉米样品 (6.2.2) 1 g（精确至 0.0001 g），同时准确称取等量的空白玉米试样用作空白试验。分别置于 20 mL 一次性注射器中，各加入 1.0 mg/mL 的胃蛋白酶溶液 (4.6) 10 mL，密封，置于水浴恒温振荡器中，37 ℃、180 r/min，消化 90 min。加入 1.0 mol/L 氢氧化钠溶液 (4.8) 0.1 mL 中和后，再加入 2.5 mg/mL 胰蛋白酶溶液 (4.7) 10 mL，混合均匀，无损转入透析袋 (4.12)，封口。
7.2.2 将透析袋放入装有 200 mL Tris-HCl 缓冲液 (4.9) 的烧杯中，置于水浴恒温振荡器中，37 ℃、180 r/min，消化 120 min。
7.2.3 取出烧杯，静置，取 20 mL 消化后上清液，置于 150 mL 三角瓶中，加入 2 mL 浓盐酸 (4.3)，高温电炉消煮，直至澄清透明，放置至室温后，以氢氧化钠溶液 (4.8) 调 pH 值至 7.6。
7.2.4 使用中速定量滤纸过滤至 50 mL 容量瓶中，并以蒸馏水清洗滤纸两次，合并滤液，加入 10 mL 钒钼酸铵显色剂 (4.11)，以去离子水定容至刻度，摇匀得到试样溶液。
7.2.5 试样溶液室温放置 10 min 后，用 1 cm 光径比色皿在 400 nm 波长下测定试样溶液的吸光度，通过工作曲线查出或回归方程计算试样溶液的磷含量。若试样溶液磷含量超过磷标准工作曲线范围，应对试样溶液进行稀释。

8 试验数据处理
单位质量的植酸酶产品释放底物中植酸磷的量以质量分数 P 计，数值以微克每克 ($mu$g/g) 表示，按公式 (1) 计算：
P ($mu$g/g) = [(m1 - m2) $ imes$ 200] / [m $ imes$ 0.2]
式中：
m1 —— 试样溶液中磷的含量，单位为微克 ($mu$g)；
m2 —— 从标准工作曲线计算得到的空白试样溶液中磷的含量，单位为微克 ($mu$g)；
m —— 试样质量，单位为克 (g)；
200 —— 试样消化液的总体积，单位为毫升 (mL)；
0.2 —— [注：原文公式片段不完整]

9 精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的 10%。