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- DB37/T 3625-2019牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程
标准号：
DB37/T 3625-2019
标准名称：
牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程
标准类别：
山东省地方标准(DB37)
标准状态：
现行-
发布日期：
2019-07-23 -
实施日期：
2019-08-23 出版语种：
简体中文下载格式：
.pdf .zip下载大小：
2.48 MB
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标准内容部分标准内容：
DB37/T3625-2019
牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程
Differential detection of Brucella pathogenic organisms in aerosol of cattle and sheep farm by Real-time PCR
【前言】
本标准按照 GB/T 1.1-2009 的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施，由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位为：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。本标准主要起草人包括：何洪彬、赵贵民、王洪梅、侯佩莉、马文青、何成强、程凯慧、杨宏军、张亮、解晓莉。
【目次】
1 范围
2 规范性引用文件
3 术语与定义
4 缩略语
5 原理
6 材料及设备
6.1 试剂
6.2 仪器设备
7 生物安全措施
8 气溶胶样品的采集、保存及运输
8.1 气溶胶样品的采集
8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理
8.3 样品的保存和运输
9 操作方法
9.1 气溶胶样本的前处理
9.2 核酸提取
9.3 荧光定量PCR检测
10 分析条件设定和结果判定
10.1 阅值设定
10.2 质控
10.3 结果分析及判定
11 注意事项
附录A（资料性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（资料性附录）
附录D（规范性附录）
1 范围
本标准规定了牛羊养殖场环境气溶胶样本中布鲁氏菌核酸荧光定量PCR鉴别诊断方法。本标准适用于牛羊养殖场环境中气溶胶布鲁氏菌核酸的检测以及牛种、羊种和猪种布鲁氏菌核酸的鉴别检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 Ct值 (Cycle Threshold)：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AGI：全玻璃液体冲击式采样器 (All-Glass-Impinger)
5 原理
本标准采用 SYBR Green I 染料实时荧光定量 PCR 技术。布鲁氏菌 IS711 (Insertion Sequence 711) 插入序列在不同种的布鲁氏菌基因组中高度保守，仅在拷贝数上存在差异。一条引物锚定在 IS711 上，另一条引物分别选在不同种布鲁氏菌 IS711 插入序列邻近的上下游单染色体 DNA 上，可以用来鉴别布鲁氏菌的种特异性。
6 材料及设备
6.1 试剂
6.1.1 试剂级别
检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。
6.1.2 引物序列
通用型上游引物 (Brucella-F)：5’-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'
通用型下游引物 (Brucella-R)：5’-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'
牛种上游引物 (Abortus-F)：5’-ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3'
羊种上游引物 (Melitensis-F)：5’-TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3'
猪种上游引物 (Suis-F)：5’-AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3'
生、羊和猪种下游共用引物 (IS711-R)：5’-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'
引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成 10μmol/L 工作液，置于 -20℃ 保存。
6.1.3 主要组分
SYBR Green I 荧光定量 PCR 反应缓冲液，采用商品化试剂。
6.1.4 对照设置
阳性对照均为疫苗株灭活后提取的核酸样本，有牛种布鲁氏菌 A19 疫苗株基因组 DNA、羊种布鲁氏菌 M5 疫苗株基因组 DNA 和猪种布鲁氏菌 S2 疫苗株基因组 DNA，需 -20℃ 保存备用。
阴性对照为采集自无布鲁氏菌污染的净化健康牛场气溶胶样本提取的基因组 DNA。
6.2 仪器设备
仪器设备及参数见附录 A。
7 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌核酸，所有检测样本应严格在 II 级生物安全柜内操作。
8 气溶胶样品的采集、保存及运输
8.1 气溶胶样品的采集
应用空气微生物采样箱，使用国际标准的 AGI 采集样本。采集方法与注意事项见附录 B。
8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理
样品采集后立即用 2% 石碳酸溶液灭活处理。
8.3 样品的保存和运输
待检样品在 2℃～8℃ 保存不应超过 24h；-20℃ 保存不超过三个月；-80℃ 以下可长期保存。样品应置于低温 (2℃～8℃)、密封的容器内运输。
9 操作方法
9.1 气溶胶样本的前处理
牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程
Differential detection of Brucella pathogenic organisms in aerosol of cattle and sheep farm by Real-time PCR
【前言】
本标准按照 GB/T 1.1-2009 的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施，由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位为：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。本标准主要起草人包括：何洪彬、赵贵民、王洪梅、侯佩莉、马文青、何成强、程凯慧、杨宏军、张亮、解晓莉。
【目次】
1 范围
2 规范性引用文件
3 术语与定义
4 缩略语
5 原理
6 材料及设备
6.1 试剂
6.2 仪器设备
7 生物安全措施
8 气溶胶样品的采集、保存及运输
8.1 气溶胶样品的采集
8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理
8.3 样品的保存和运输
9 操作方法
9.1 气溶胶样本的前处理
9.2 核酸提取
9.3 荧光定量PCR检测
10 分析条件设定和结果判定
10.1 阅值设定
10.2 质控
10.3 结果分析及判定
11 注意事项
附录A（资料性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（资料性附录）
附录D（规范性附录）
1 范围
本标准规定了牛羊养殖场环境气溶胶样本中布鲁氏菌核酸荧光定量PCR鉴别诊断方法。本标准适用于牛羊养殖场环境中气溶胶布鲁氏菌核酸的检测以及牛种、羊种和猪种布鲁氏菌核酸的鉴别检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 Ct值 (Cycle Threshold)：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AGI：全玻璃液体冲击式采样器 (All-Glass-Impinger)
5 原理
本标准采用 SYBR Green I 染料实时荧光定量 PCR 技术。布鲁氏菌 IS711 (Insertion Sequence 711) 插入序列在不同种的布鲁氏菌基因组中高度保守，仅在拷贝数上存在差异。一条引物锚定在 IS711 上，另一条引物分别选在不同种布鲁氏菌 IS711 插入序列邻近的上下游单染色体 DNA 上，可以用来鉴别布鲁氏菌的种特异性。
6 材料及设备
6.1 试剂
6.1.1 试剂级别
检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。
6.1.2 引物序列
通用型上游引物 (Brucella-F)：5’-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'
通用型下游引物 (Brucella-R)：5’-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'
牛种上游引物 (Abortus-F)：5’-ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3'
羊种上游引物 (Melitensis-F)：5’-TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3'
猪种上游引物 (Suis-F)：5’-AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3'
生、羊和猪种下游共用引物 (IS711-R)：5’-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'
引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成 10μmol/L 工作液，置于 -20℃ 保存。
6.1.3 主要组分
SYBR Green I 荧光定量 PCR 反应缓冲液，采用商品化试剂。
6.1.4 对照设置
阳性对照均为疫苗株灭活后提取的核酸样本，有牛种布鲁氏菌 A19 疫苗株基因组 DNA、羊种布鲁氏菌 M5 疫苗株基因组 DNA 和猪种布鲁氏菌 S2 疫苗株基因组 DNA，需 -20℃ 保存备用。
阴性对照为采集自无布鲁氏菌污染的净化健康牛场气溶胶样本提取的基因组 DNA。
6.2 仪器设备
仪器设备及参数见附录 A。
7 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌核酸，所有检测样本应严格在 II 级生物安全柜内操作。
8 气溶胶样品的采集、保存及运输
8.1 气溶胶样品的采集
应用空气微生物采样箱，使用国际标准的 AGI 采集样本。采集方法与注意事项见附录 B。
8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理
样品采集后立即用 2% 石碳酸溶液灭活处理。
8.3 样品的保存和运输
待检样品在 2℃～8℃ 保存不应超过 24h；-20℃ 保存不超过三个月；-80℃ 以下可长期保存。样品应置于低温 (2℃～8℃)、密封的容器内运输。
9 操作方法
9.1 气溶胶样本的前处理
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