【地方标准】 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检测

DB22/T1821—2013 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检测
Detection of trichothecenes-producing fungi in grains by PCR method
发布：2013-05-15，实施：2013-09-01
吉林省质量技术监督局

前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001的规则起草，由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位为吉林省产品质量监督检验院及中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。主要起草人包括史艳宇、华蕾、刘金华、王莹、李媛媛、初真林、王伟、刘静秋、周亮、王潇、刘晓晖、王颗、任明月。

1 范围
本标准规定了粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检验方法，适用于粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的快速筛选。

2 规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用是必不可少的：
- GB4789.15 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
- GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
- GB19489 实验室生物安全通用要求
- WS/T230
注：凡注日期的引用文件，仅所注日期版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本标准。

3 原理
在临床诊断中，聚合酶链式反应（PCR）技术用于检测单端孢霉烯前体（trichodiene）合成酶，该酶催化所有真菌单端孢霉烯族化合物合成反应的第一步。根据关键基因tri5的存在与否，可判断待检样品是否被产单端孢霉烯族化合物的真菌污染。

4 试剂和材料
除特别说明外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。
4.1 水：符合GB/T6682一级水规格。
4.2 马铃薯-葡萄糖-琼脂（PDA）：按GB4789.15规定。
4.3 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB、1400 mmol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris，用10% HCl调pH至8.0，高压灭菌121℃ 20 min，储存于2~8℃。
4.4 TE缓冲液：10 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、1% 十二烷基磺酸钠，用10% HCl调pH至8.0，高压灭菌121℃ 20 min，储存于2~8℃备用。
4.5 RNA酶溶液（5 μg/μL）。
4.6 蛋白酶K（20 mg/mL）。
4.7 Tris饱和酚。
4.8 酚：三氯甲烷：异戊醇（25:24:1 或 24:1）。
4.9 异丙醇。
4.10 70% 乙醇。
4.11 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4）、200 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl2。
4.12 引物：上游 5'-GGGATGCTGGATTGAGCAG-3'，下游 5'-CATCACCTGAGGGTCCTTGT-3'。
4.13 Taq DNA聚合酶。
4.14 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
4.15 分子量标记：100 bp DNA Marker。
4.16 650×TAE电泳缓冲液：484 g Tris、114 mL 冰醋酸、200 mL 0.5 mol/L EDTA，加水定容至2 L，高压灭菌，使用前稀释成1×工作液。
4.17 6×加样缓冲液：30 mmol/L EDTA、36% 甘油、0.05% 二甲苯蓝FF、0.05% 溴酚蓝。
4.18 琼脂糖：电泳纯。
4.19 阳性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的禾谷镰刀菌标准菌株。阴性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的非目标菌株。

5 仪器和设备
5.1 天平：感量0.001 g。
5.2 生物安全柜：AII型。
5.3 霉菌培养箱：28℃ ± 1℃。
5.4 高压灭菌器。
5.5 恒温水浴锅：65℃ ± 1℃。
5.6 高速冷冻离心机：转速不低于12000 r/min。
5.7 PCR仪。
5.8 核酸电泳仪。
5.9 凝胶成像分析系统。
5.10 紫外分光光度计。
5.11 涡旋混合器。
5.12 微量移液器：0.2~2 μL、2~10 μL、20~200 μL、100~1000 μL。
5.13 离心管：1.5 mL。

生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行真菌检测，所有培养物和实验操作必须遵循实验室生物安全要求。