【地方标准】 食品中马、驴源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法

ICS 67.050
X 04
DB64 宁夏回族自治区地方标准
DB64/T964-2014
食品中马、驴源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法
Identification of horse and donkey derived materials in food Real-time PCR method

2014-07-18 发布
宁夏回族自治区质量技术监督局
2014-07-18 实施

前言
本标准参照 SV/T 2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法》制定。本标准编写格式符合 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求。本标准由宁夏回族自治区质量技术监督局归口，由宁夏回族自治区食品检测中心起草。本标准主要起草人：岳苑、郭晓明、冯秀娟、高琳、贾冰凝。

范围
本标准规定了食品中马、驴源性成分的实时荧光PCR检测方法，适用于肉及肉制品中马、驴源性成分的定性检测。该方法的检出限为0.1%。

规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本标准。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27025-2008 检测和校准实验室能力的通用要求
GB/T 27103-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
3.1.1 马源性成分 horse-derived materials：马种属特异性DNA片段。
3.1.2 驴源性成分 donkey-derived materials：驴种属特异性DNA片段。
3.1.3 实时荧光PCR real-time fluorescent PCR：实时荧光聚合酶链式反应。
3.1.4 Ct值 Cycle threshold（Ct）：每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

3.2 缩略语
DNA：deoxyribonucleic acid（脱氧核糖核酸）
PCR：polymerase chain reaction（聚合酶链式反应）
Taq：Thermus aquaticus（水生栖热菌）
FAM：6-carboxyfluorescein（6-羧基荧光素）

原理
本标准采用 TaqMan 实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA上动物种间多态性差异进行动物源性种类鉴定。通过标记荧光物质（FAM）的特异性探针进行扩增检测。内参照（Internal Control）同时进行扩增，用于监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。通过实时荧光PCR扩增曲线实现对马、驴源性成分的快速检测。

仪器设备
5.1 实时荧光PCR检测系统
5.2 高速冷冻离心机（转速12000 r/min以上）
5.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
5.4 冰箱（2℃~8℃及-20℃或-80℃）
5.5 微量可调移液器（0.5 μl~10 μl，10 μl~100 μl，20 μl~200 μl，100 μl~1000 μl）
5.6 恒温加热器
5.7 可移动紫外灯
5.8 分析天平（感量0.1 mg）
5.9 高压灭菌锅
5.10 干热灭菌器

材料及试剂
6.1 材料：实时荧光PCR反应管、离心管。
6.2 试剂：除特别说明外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，水应符合 GB/T 6682-2003 一级水标准。试剂应使用无DNase污染的容器分装。试剂的选购、验收及储存应符合 GB/T 27025-2018 要求。
6.2.1 基因组DNA提取试剂盒：提取步骤及使用注意事项参见附录A。
6.2.2 荧光定量PCR反应预混液：使用方法及注意事项参见附录B。
6.2.3 引物及探针：给出信息仅供使用本标准参考，并不表示对产品认可。如其他等效产品具有相同效果，可使用等效产品。
6.2.3.1 马源性成分
引物：5'-gacacacccagaagtaaagaca-3'、5'-igctgggatatatgatgatcaga-3'
探针：FAM-aicaaacacLcigccectlgagaatca-TAMRA
6.2.3.2 驴源性成分
引物：5'-tgctagcctcattatcagtat-3'、5'-gtgatgaggatacgtgct-3'
探针：FAM-lclaccaatcatatcatcaatcc