【地方标准】 H5N8亚型禽流感流行毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法

DB22/T2909—2018
H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法
Method of the real-time PCR for the detection of HA and NA genes of Avian influenza subtype H5N8

发布日期：2018-11-12
实施日期：2018-12-30
发布单位：吉林省市场监督管理厅

前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局）提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。
本标准主要起草人：王伟利、姚贵哲、孟庆峰、刘金华、王岸英、王准、肖芳、马玲。

1 范围
本标准规定了H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、材料与试剂、仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理技术要求。本标准适用于H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T19438.1 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法

3 缩略语
下列缩略语适用于本文件
RT-PCR：反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold）
RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）
DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethyl pyrocarbonate）
HA：血凝素（hemagglutinin）
NA：神经氨酸酶（neuraminidase）
Taq酶：Taq脱氢嗜核酸聚合酶（Thermus aquaticus DNA polymerase）

4 原理
根据H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列设计引物和探针，探针结合部位在扩增片段内部。HA基因和NA基因探针分别在5'端标记VIC和FAM荧光基团作为报告荧光基团，3'端分别标记MGB和BHQ1作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目标基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进入延伸阶段时，Taq酶发挥5'→3'的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。

5 材料与试剂
5.1 材料
5.1.1 离心管（1.5mL、0.2mL）。