【地方标准】 牛结核病γ干扰素酶联免疫吸附试验诊断技术

ICS 11.220
B41
DB37
山东省地方标准
DB37/T 2311—2013

牛结核病干扰素酶联免疫吸附试验诊断技术

Diagnostic Criteria on Bovine Tuberculosis by Enzyme-linked Immunoassay of Interferon

2013-04-01发布
2013-05-01实施

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由山东省畜牧兽医局提出。
本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国兽医药品监察所、山东省动物疫病预防与控制中心。
本标准主要起草人：杨宏军、高运东、丁家波、田夫林、何洪彬、张亮、宋玲玲、侯佩莉、侯明海、仲峰。

1 范围
本标准规定了牛结核病干扰素ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判定和操作注意事项等。
本标准所规定的技术适用于牛感染结核分枝杆菌或牛分枝杆菌时干扰素的检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术
GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

3.1 牛结核病 bovine tuberculosis
由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）或结核分枝杆菌（M. tuberculosis）所引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病，可通过病畜传染给人和其它动物。

3.2 γ-干扰素 γ-Interferon
T淋巴细胞受到结核杆菌抗原刺激后释放的细胞因子，作为重要的巨噬细胞活化因子，在对结核分枝杆菌的免疫应答中发挥重要的作用，可通过干扰素的检测来实现对结核杆菌感染的诊断。

4 试剂及仪器

4.1 试剂
4.1.1 血液培养所需材料
血液培养所需材料见附录A。

4.1.2 ELISA所需试剂
ELISA所需试剂见附录B。

4.2 仪器
检测所需仪器：
a) 37℃培养箱；
b) 精密可调移液器（1mL）；
c) 1mL、5mL、10mL的移液器；
d) 100mL、1L、2L的量筒；
e) 6L去离子水或蒸馏水；
f) 12道移液器（50μL-300μL）；
g) 微量振荡器（可选）；
h) 洗板机；
i) 酶标仪（含450nm和650nm滤光片）。

5 检测方法（干扰素ELISA诊断方法）

5.1 试剂配制
检测所需试剂及制备方法按附录C的规定。

5.2 检测步骤

5.2.1 全血培养

5.2.1.1 采血
将采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解，室温（22℃±5℃）下运送到实验室并在采血后30h内进行培养，运送和储存过程中切勿冷冻血液。

5.2.1.2 血液分装
分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装的抗凝血（见表1）。用一次性自动移液器或吸管在无菌条件下进行操作。

表1 吸取血液或抗原至24孔培养板的推荐操作
1号动物：NILA1, AvPPDA1, BoPPDA1
2号动物：NILA2, AvPPDA2, BoPPDA2
3号动物：NILB1, AvPPDB1, BoPPDB1
4号动物：NILB2, AvPPDB2, BoPPDB2
5号动物：NILC1, AvPPDC1, BoPPDC1
6号动物：NILC2, AvPPDC2, BoPPDC2
7号动物：NILD1, AvPPDD1, BoPPDD1
8号动物：NILD2, AvPPDD2, BoPPDD2
注：NIL=阴性对照抗原（无菌PBS）；AvPPD=禽型提纯结核菌素；BoPPD=牛型提纯结核菌素。

5.2.1.3 加入刺激抗原
5.2.1.3.1 无菌加入100μL PBS（阴性抗原对照），高禽PPD或牛PPD至相应的孔。
5.2.1.3.2 抗原应与分装的血液充分混匀，用微量振荡器高速振荡1min。如果没有合适的仪器，应将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10次。

5.2.1.4 孵育
将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16h～24h。

5.2.1.5 血浆样品的收获
用可调移液器小心吸取约400μL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。污染极少量红细胞不会影响γ-干扰素酶免疫试验。

5.2.1.6 血浆的贮存
血浆可在2～8℃贮存7天，在-20℃可贮存几个月。贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。应在样品架上标记日期、操作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。

5.2.2 牛γ-干扰素酶免疫试验

5.2.2.1 溶解冻干试剂，按“操作注意事项”平衡其他试剂。
5.2.2.2 加入50μL绿色稀释液至所需孔。
5.2.2.3 用排枪将50μL待测样品和对照样品加至含有绿色稀释液的相应孔中。对照样品应最后加入。在微量振荡器上振荡1min，彻底混匀。如无微量振荡器，可上下吹吸5次。
5.2.2.4 封板，室温（22℃±5℃）孵育60±5min。洗涤6次。用洗液充满各孔（约300μL/孔），但不要引起相邻孔的交叉污染，倒掉洗液，重复操作5次。第6次洗涤完毕后，将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次，尽量除去残留的洗液。
5.2.2.5 每孔加入100μL新鲜配制的酶标结合物，充分振荡混匀。按表2用蓝色稀释液稀释酶标结合物。
5.2.2.6 封板，室温孵育60±5min。
5.2.2.7 洗涤6次。
5.2.2.8 每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液，充分振荡混合。按表3配置底物溶液。
5.2.2.9 封板，室温避光孵育30min。
5.2.2.10 每孔加入50μL终止液，轻轻摇动混匀。终止后5min内读出OD450nm，以650nm作为参照波长，然后用OD450nm值计算结果。

5.2.3 质量控制（试验的有效性）

5.2.3.1 在判定结果前应检查对照样品的结果，计算阴性对照和阳性对照的平均OD值。
5.2.3.2 试验合格可接受的平均OD值范围：
a) 牛干扰素阴性对照 <0.130，各阴性对照重复孔差值不能大于0.040；
b) 牛干扰素阳性对照 >0.700，阳性对照重复孔OD值的变化幅度不超过其平均OD值的30%。
5.2.3.3 如果试验中不符合任何一条上述条件，试验视为无效，应重新检测。

6 结果判定

6.1 计算每个样品阴性抗原、禽PPD和牛PPD的平均OD值。如果做重复孔，应计算每头动物所有样品阴性抗原、禽PPD和牛PPD的平均OD值。
6.2 阴阳性结果判定标准：