【农业行业标准(NY)】 增产菌生产工艺流程

NY335—1998
本标准由农业部科学技术与质量标准司提出并归口。本标起草单位：中国农业大学。本标准主要起草人：梅汝鸿、徐维敏、蒋慧敏。495
中华人民共和国农业行业标准
增产菌生产工艺流程
Production technological process of yield-increasing bacteria1范围
NY 335—1998
本标准规定了增产菌芽孢杆菌（Bacillus sp.)的生产工艺流程、技术要求和操作规程。本标准适用于以芽孢杆菌为菌种，经液体深层发酵法生产增产菌粉剂产品的发酵工艺引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。HG/T3309—1983农药粉剂细度测定方法（原HG/T2-896--83）NY334--1998增产菌粉剂
3总则
增产菌属芽孢杆菌是依据植物微生态学原理研制出的一种微生态制剂。增产菌生产工艺流程选用芽孢杆菌为菌种，经液体深层发酵法制成粉剂。主要环节为原菌种活化一→菌种扩大培养→种子罐培养→发酵罐培养→添加填充料→压滤→干燥→粉碎→粉剂质量检测包装→产品检测。
4技术要求
技术要求见表1。
灭菌要求
培养条件
放罐指标
项目名称
通气量
含菌量
芽孢形成量
杂菌量
中华人民共和国农业部1998-06-11批准19
技术指标
121～125℃
实消压力0.11MPa
空消压力0.11MPa
28~30℃
0. 05 MPa此内容来自标准下载网
1：1(每分钟进出空气体积比）
7. 0~7. 5
≥30亿个/g
1999-01-01实施
成品标准
生产工艺流程
项目名称
含菌α
含水蟹
杂菌量
NY 335—1998
表1(完）
技术指标
300亿个/起
0.09mm孔径筛
原菌种活化→菌种扩大培养→发酵罐培养一加填充料→压滤一干燥粉碎→成品检验→包装6菌种生产操作规程
6.1仪器设备和试剂
无菌室或超净工作台、灭菌锅、试管、克氏瓶、冰箱、温箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氟化钠、牛肉膏、蛋白陈和琼脂等。
6.2培养基制备
按如下配方制备培养基：牛肉膏0.3%，蛋白陈1%，氯化钠0.5%，琼脂2%。将琼脂加热溶化后用0.1mo1/1.氢氧化钠藏0.1mol/1盐酸调pH值7.0~7.5，然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在0.11MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。6.3菌种活化与扩大培养
用培养基在无菌条件下从原菌种斜面上挑取少许菌苔，置放试管斜面内进行划线，然后置28～30C温箱内培养24h.经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于28～30℃温箱内培养2428h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片、染色检查无杂菌，芽孢大小一致的，可放冰箱中存放备用（4左右为宜）。涂片、染色方法按7.2.8.3规定进行。
发酵生产操作规程
7.1仪器设备和试剂
种子罐、发酵罐、水浴锅、显微镜、载玻片、克氏瓶、三角瓶、试管、吸管、血球计数板、氢氧化钠、盐酸氯化钠、PH试纸、酒精、品红、孔雀绿等。7.2种子罐培养
7.2.1培养基
种子罐培养基所用碳原主要有葡药糖、玉米浆、淀粉、糊精、植物油（兼消泡剂）：氮原主要有花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、无机盐及微量元素。般发酵参考如下配方装料：花生饼粉0.5%，鱼粉0.3%，玉米浆0.5%，葡糖0.3%，豆油0.2%~0.3%或泡敌0.3%）。7.2.2空发酵罐灭菌
发酵罐在应用前清洗干净，排除污物、并在0.11MPa压力下灭菌30min。7.2.3种子罐装料
参考7.2.1的配方比例装料，投料量不得超过罐容积的70%。7.2.4发酵罐灭菌
装好料后，在0.11MPa力下灭菌30mim冷却至30℃后即可接种。7.2.5种子罐接种
7.2.5.1悬浮液制备
在无菌条件下将每个克氏瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌菩刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10亿个菌体/ml并在80C恒温水锅中处理20min。497
7.2.5.2接种
NY 335 -- 1998
将制好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按1%的比例接种于冷却至30℃的种子罐内进行培养。
7.2.6种子罐培养条件的控制
接种后在温度为2830C，压力0.05MPa.通气量1：1（每分钟进出空气体积比）和220r/min搅拌条件下，培养8~10h。
7.2.7发酵罐培养过程中的检测
接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，包括菌体生长状况、含菌量和pH值，达到如下指标，即可移种至发酵罐内发酵培养。
a）菌体生长整齐；
b）处于对数生长期；
e）含菌量2亿个/m以上；
d）无杂菌污染。
7.2.8检测方法
7.2.8.1取样
在无菌条件下，取培养液50~100ml于灭菌三角瓶中，检测备用。7.2.8.2pH值的调节
用pH试纸（适用范围pH值4～8）进行比色，用滴管将滴发酵液滴到pH试纸上，观察试纸上指示剂颜色变化、用比色卡进行比色来确定发酵液的pH值，并用1mol/L.的氢氧化钠或盐酸调节发酵液的pH值，使发酵液pH值保持在7.0~7.5左右。7.2.8.3菌体生长状况
用涂片、染色法观察菌体生长状况。用无菌吸管或接种环取发酵液-滴或2～3滴，置于洁净载玻片上，用移种环在玻片上均匀涂抹，干燥后用孔雀绿、藏红染色法将菌体和芽孢染成不同颜色，在显徽镜下观察。
7.2.8.4染色步骤
孔雀绿0.5%的水溶液染色剂I或碱性品红配制成0.05%的水溶液染色剂1。在固定好的涂片上加染色剂1，置酒精灯火焰上微加热染色1min，勿使染色液沸腾和干燥，用水洗去染色液后，加染色剂染色15min，再用水洗去染色液，用吸水纸吸干可在显微镜下观察，注意此时菌体染成微红色，芽抱染成绿色。
7.2.8.5含菌（孢）量检测
用血球计数法观察菌体孢体的数量，将发酵液用无菌水稀释至10°~101倍备用（至适宜的倍数为准）。再将洁净盖玻片放在血球计数板上有刻度的位置上，从盖玻片的侧加小滴稀释的发酵液（使每小格只有5～10孢子为宜）。再在显微镜下观察每个小格的芽茅孢菌数目，每视野观察80个小格，以平均数乘以10°，再以稀释倍数，即为发酵液的含菌数。每次计数测定应不少于五个视野数（即不少于5×80个小格的平均数）。其含菌量n：按式（1）计算：D×C× 4×10
式中C稀释倍数；
D——80个小格的芽孢总数；
4×10—如球计数板每小格容积换算成1ml.容积的常数。7.3发酵罐发酵生产
7.3.1发酵罐空消
发酵罐在接种前要经过严格灭菌处理，洗净后在0.11MPa压力下灭菌30min。19s
7.3.2发酵罐投料
NY335-1998
配方：花生饼粉2%鱼粉0.3%，玉米浆1.8%，糊精0.5%，硫酸镁0.075%，碳酸钙0.5%，磷酸二氢钾0.04%，豆油0.1%或泡敌0.05%，用1mol/1.氢氧化钠或1mol/L盐酸调pH值7.0~7.5左右，投料量不得超过罐容积的70%。
7.3.3发酵罐培养
发酵培养条件：搅拌速度180～200r/min，罐压0.05MPa，移种后4h内通气量为1：0.7～0.8（每mn体积之比），以后逐渐增大至1：1。-般发酵塔养周期为18～24h，在芽孢大量形成，个别芽孢开始脱落时，符合7.3.5放罐指标，即可放罐。7.3.4发酵过程中的检测内容及捡测方法投料后4h开始，每隔2h取样检测次，至18h后，取样间隔缩短为0.5-~1h。达到如下指标即可放罐。
）芽孢含量≥70%；
b）杂菌污染≤0.3%；
c）含菌量≥30亿个/ml。
7.3.5检测指标与检测方法同7.2.7和7.2.8。8后处理操作规程
8.1仪器设备
搅拌机、板框，干燥机（装置）、超细度粉碎机等。8.2吸附剂
~般采用的粒度为0.09mm孔径筛的轻质碳酸钙为吸附填加剂，加入量按式（2)计算：吸附剂的量 = 发酵液体积杀发酵液含菌量 + 50% ~ 80% 固体投料量300亿个/起
8.3压滤
按8.2规定加入吸附剂后，机械搅拌3-6h，使菌孢全部被吸附，然后再用板框压滤。+**（2）
8.4干燥
将板框压滤后的滤饼捣碎后，置于烘干机或烘干装置内进行烘干。烘干时的温度不超过70，要不断翻动，使受热均匀。当含水率5%时，即可进行粉碎、包装。8.5粉碎
利用高细度粉碎机粉碎，100%通过0.09mm孔径筛。9成品检骏
按NY334斑行。含水率用干燥失慧法（重量法）测定，含水率≤5%为合格，细度采用湿筛法测定，100%通过0.09mm孔径筛为合格，具体方法按HG/T3309—1983中湿筛法测定。10包装
按NY334执行。用聚乙烯袋20g包装，每50袋装一大袋，每箱10大袋，净重10kg，于干燥通风处存，保存期3年。
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