【地方标准】 饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法

ICS 65.120
B 20
DB41
河南省地方标准
DB41/T 1727—2018
饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法

2018-11-26发布
2019-02-26实施
河南省质量技术监督局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由河南省畜牧局提出并归口。
本标准起草单位：河南海瑞正检测技术有限公司、河南牧业经济学院、河南省兽药饲料监察所。
本标准主要起草人：兰尊海、单慧燕、易善平、文英会、陈晓鸽、薛宁、许亚楠、李培娜、孙世雯。

1 范围
本标准规定了饲料中天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸和色氨酸共18种氨基酸的测定方法。
本标准适用于饲料原料和饲料中氨基酸含量的测定。酸水解法适用于除色氨酸外其它氨基酸的测定；碱水解法只适用于色氨酸的测定。

2 规范性引用文件
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GB/T 18246 饲料中氨基酸的测定

3 原理
蛋白质在盐酸或氢氧化钠的作用下，水解成单一氨基酸，水解后的氨基酸与衍生试剂反应，形成稳定的黄色衍生物，经C18色谱柱分离，紫外检测器检测，与氨基酸标准峰比较，按外标法计算各氨基酸的含量。

4 试剂和材料
4.1 试剂
4.1.1 盐酸（HCl）：浓度36%，优级纯。
4.1.2 氢氧化钠（NaOH）：优级纯。
4.1.3 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
4.1.4 碳酸氢钠（NaHCO3）。
4.1.5 无水乙酸钠（CH3COONa）。
4.1.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
4.1.7 N,N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）：色谱纯。
4.1.8 冰乙酸（CH3COOH）。

4.2 试剂配制
4.2.1 盐酸溶液（6 mol/L）：取500 mL盐酸加水稀释至1000 mL，混匀。
4.2.2 氢氧化钠溶液（5 mol/L）：称取200 g氢氧化钠，溶于200 mL水中，冷却至室温后，用水稀释至1000 mL，混匀。
4.2.3 平衡缓冲溶液（pH 7.0）：称取3.4 g磷酸二氢钾加入145.5 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，用水稀释至500 mL，混匀，抽滤，贮存于棕色瓶中。
4.2.4 衍生试剂（1%）：称取1 g氟苯，用乙腈溶解稀释至100 mL，混匀。
4.2.5 衍生缓冲液（pH 9.0）：称取21.0 g碳酸氢钠加入470 mL水溶解过滤，加入30 mL乙腈于500 mL试剂瓶中。
4.2.6 流动相（0.05 mol/L）：称取4.1 g无水乙酸钠，加入100 mL N,N-二甲基甲酰胺定容至1000 mL容量瓶中，用20%冰乙酸调节pH至6.4，备用。

4.3 标准品
4.3.1 混合氨基酸标准溶液：经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液。
4.3.2 18种单个氨基酸标准品：固体，纯度≥98%。

4.4 标准品配制
4.4.1 混合氨基酸标准工作液（100 μg/mL）：购买市售的氨基酸标准溶液。
4.4.2 L-色氨酸标准工作液（100 μg/mL）：准确称取L-色氨酸标准品约10.00 mg，溶于少许水和数滴0.1 mol/L氢氧化钠溶液中，冷却至室温，用水稀释至100 mL，混匀，为标准上机液。

5 仪器和设备
5.1 实验室用粉碎机。
5.2 样品筛：孔径0.25 mm。
5.3 分析天平：感量为0.1 mg。
5.4 电热鼓风干燥箱。
5.5 真空泵。
5.6 喷灯。
5.7 快速混匀器。
5.8 高效液相色谱仪：附紫外检测器、二元泵或四元泵、柱温箱。

6 分析步骤
6.1 试样制备
取具代表性的饲料样品，用四分法缩分取250 g左右，粉碎并过筛0.25 mm孔径（40目）筛，充分混匀后装入样品瓶（或袋）中备用。

6.2 试样水解
酸水解法：称取0.1 g~0.5 g试样（准确至0.0001 g）于Φ1.8 cm×20 cm水解管中，加10 mL盐酸溶液（4.2.1）后，按照GB/T 18246—2000中3.1进行酸水解处理。打开水解管，将水解液过滤至50 mL容量瓶中，用少量水多次冲洗水解管，水解液移入同一容量瓶中，最后用水定容至刻度，振荡混匀。
碱水解法：称取0.4 g~0.6 g饲料试样（准确至0.0001 g）于Φ1.8 cm×20 cm水解管中，加10 mL氢氧化钠溶液（4.2.2）后，按照GB/T 18246—2000中3.2进行碱水解处理。打开水解管，先用10 mL的盐酸溶液（4.2.1）转移至50 mL容量瓶中，用少量水多次冲洗水解管，水解液移入同一容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。

6.3 试样衍生
准确移取样品溶液和标准溶液各10 μL于小试管中，抽干，准确加入衍生缓冲液20 μL，用快速混匀器混匀，再加衍生试剂20 μL，混匀，封口膜封口，放入电热鼓风干燥箱中60℃衍生30 min，取出放至室温，加平衡缓冲液160 μL，混匀。

6.4 色谱条件
6.4.1 二元或四元泵高效液相色谱仪。
6.4.2 紫外检测器。
6.4.3 柱温箱。
6.4.4 手动或自动进样器。
6.4.5 色谱柱：C18柱（内径：4.6 mm，长：250 mm，粒径5 μm）。
6.4.6 流动相：A-0.05 mol/L乙酸钠溶液；B-乙腈：水=1:1。洗脱梯度见表1。

表1 洗脱梯度
序号 | 时间/min | A% | B%
1 | 0.0 | 84.0 | 16.0
2 | 0.3 | 84.0 | 16.0
3 | 4.0 | 69.0 | 31.0
4 | 9.5 | 64.0 | 36.0
5 | 17.0 | 45.0 | 55.0
6 | 28.0 | 40.0 | 60.0
7 | 34.0 | 0.0 | 100.0
8 | 38.0 | 0.0 | 100.0
9 | 39.0 | 84.0 | 16.0
10 | 46.0 | 84.0 | 16.0

6.4.7 流速：1.20 mL/min。
6.4.8 柱温：25℃。
6.4.9 检测波长：360 nm。
6.4.10 进样量：10 μL。

6.5 试样的测定
混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入高效液相色谱仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的含量。

7 分析结果的表述
7.1 样品中氨基酸含量的计算
样品测定液氨基酸的含量按下列公式计算：