【地方标准】 牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程

DB63/T 1163—2012 耗牛体外受精胚胎生产技术操作规程

备案号：35830-2013
发布单位：青海省质量技术监督局
发布日期：2012-12-04
实施日期：2013-01-01

前言
本规程依据GB/T 1.1—2009的规则编写。本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。本规程起草单位：青海省畜牧兽医科学院畜牧研究所。本规程主要起草人：徐惊涛、孙永刚、才让东智、马志杰。

1 范围
本规程规定了耗牛体外受精胚胎生产的术语和定义、耗牛卵母细胞分级、体外成熟、体外受精及受精卵体外培养的方法和耗牛胚胎分级。本规程适用于耗牛体外受精胚胎生产技术推广应用的规范化操作。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4143 牛冷冻精液
GB/T 25881 牛胚胎
NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程

3 术语与定义
下列术语和定义适用于本规程。
3.1 卵母细胞体外成熟 (In vitro maturation, IVM)：指从活体或离体牛牛卵巢的卵泡中采集未成熟的卵母细胞，在体外进行培养，使之恢复减数分裂到MII期并具备受精能力的发育过程。
3.2 体外受精 (In vitro fertilization, IVF)：通过人为操作使哺乳动物的精子和卵子在体外环境中完成受精过程的技术。
3.3 体外胚胎生产技术 (In vitro embryo production, IVEP)：通过采集耗牛卵母细胞，将之经过体外成熟培养 (In vitro maturation, IVM) 后与获能的精子进行体外受精 (In vitro fertilization, IVF)，再经过受精卵的体外培养 (In vitro culture, IVC) 等一系列过程，在体外生产出可用于移植胚胎的技术。

4 试剂、耗材、设备和实验室要求
4.1 试剂：所用的试剂、药品以及要求见附录A。
4.2 耗材：所用耗材见附录A。
4.3 设备：所用主要设备见附录A。
4.4 实验室要求：工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积不小于3平方米，并设有更衣柜和紫外灯。紫外灯管距地面不应超过2.5米，每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，每次照射时间为20分钟~30分钟。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。各种器具的清洗、消毒见附录B。

5 卵母细胞采集
5.1 活体采卵：借助超声波探测仪直接从活体耗牛的卵巢中吸取卵母细胞。其方法是：直肠把握卵巢，用超声波显像仪和7.5/5.0兆赫兹阴道扇形探头观察卵巢形态和卵泡位置，使卵泡位于采卵器的进针线上，然后开启真空泵并推进19号采卵针（长60厘米）对卵泡进行穿刺，将含有卵母细胞的卵泡液抽入集卵杯。采卵液的配置见附录C。
5.2 屠宰后的耗牛卵母细胞的采集：耗牛屠宰后30分钟内从体内摘取卵巢，置于25℃~35℃含青霉素（100单位/毫升）和链霉素（100微克/毫升）的生理盐水中，2小时内运回实验室，在无菌条件下洗涤卵巢、去除其周围结缔组织后，用消毒后的纱布或木质纤维纸巾沾干上面的生理盐水并包裹后，使用带18号针头的10毫升一次性注射器从卵巢内部抽取表面直径2毫米~6毫米卵泡。
5.3 耗牛卵母细胞筛选：将收集到的卵泡液转入直径00毫米培养皿中，在实体显微镜下检出卵丘-卵母细胞复合体 (Cumulus-oocyte complexes, COCs)，如下方法进行分类，A、B级用于体外受精：
A级：卵丘细胞层完整而致密、细胞大小正常，细胞质均匀，颜色较暗并充满透明带；
B级：卵丘细胞不够完整或较松散，层较少，细胞颜色稍浅；
C级：卵丘细胞少或膨大变性，卵母细胞颜色浅或裸卵。

6 耗牛卵母细胞体外成熟
6.1 卵母细胞成熟培养：在直径60毫米无菌培养皿中用卵母细胞成熟培养液制作10个体积为50微升培养滴，覆盖石蜡油后在CO2培养箱平衡2小时。将收集的A级和B级COCs在成熟培养液清洗3遍后，每15个COCs转入50微升成熟培养微滴中，置入39℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养24小时。卵母细胞成熟培养液的配制见附录C。
6.2 卵母细胞成熟的判定：显微镜下观察培养24小时的耗牛卵母细胞，卵丘细胞膨大扩散，卵母细胞质均匀、没有空泡，用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞后能见到第一极体 (PB1) 为已成熟，否则为未成熟卵。