【地方标准】 甘薯品种真实性鉴定 ISSR法

ICS 65.020.99
B04
DB42/T1438—2018
甘薯品种真实性鉴定 ISSR法
Verification of genuineness for sweet potato ISSR

2018-09-11发布
2018-12-10实施
湖北省质量技术监督局 发布

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准由湖北省农业科学院提出。
本标准由湖北省农业科学院归口管理。
本标准起草单位：湖北省农业科学院粮食作物研究所。
本标准主要起草人：杨新笋、王连军、雷剑、苏文瑾、柴沙沙、焦春海、宋峰。

目次
1 范围
2 术语和定义
2.1 聚合酶链式反应
2.2 简单重复序列区间
2.3 引物
3 甘薯品种真实性鉴定
3.1 DNA提取
3.2 ISSR扩增
3.2.1 反应体系
3.2.2 反应程序
3.3 PCR产物的电泳检测
3.4 数据记录
3.5 结果分析
附录A（资料性附录）引物清单
附录B（资料性附录）湖北省主栽品种相应指纹图谱

1 范围
本标准规定了甘薯品种真实性鉴定ISSR法。
本标准适用于湖北省甘薯品种和种质真实性的鉴定，包括地方品种、选育品种、品系和国外引进种质资源。

2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。

2.1 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）
是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。

2.2 简单重复序列区间（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）
是在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法。根据某个简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，通过PCR反应扩增微卫星位点间隔的碱基序列，以检测其扩增片段长度的多态性。

2.3 引物（Primer）
复制起始时为DNA聚合酶提供游离的3'羟基作为复制起点的物质。体内DNA复制引物一般是RNA，有时也可以由DNA或者蛋白质替代；体外引物是一段DNA。

3 甘薯品种真实性鉴定

3.1 DNA提取
采用SDS法：取甘薯种薯幼苗新鲜幼嫩叶片0.1 g于研钵中，加液氮速冻后立即研磨成粉末。转移粉末至预冷的1.5 mL离心管中，加入400 μL预热至65℃的SDS提取缓冲液（含有2%体积的β-巯基乙醇）、100 μL的10% SDS，然后65℃水浴20 min，其间轻轻颠倒混匀数次。10000 rpm离心10 min，取上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀，10000 rpm离心10 min。取上清加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），颠倒混匀，-20℃放置1 h。用带有弯钩的毛细管将絮状DNA钩出，放入70%乙醇中洗涤2次，空气干燥30 min。溶解于100 μL灭菌去离子水中，-20℃保存。

注：以上为推荐的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用于本标准。

3.2 ISSR扩增

3.2.1 反应体系