【地方标准】 淡水生物环境DNA监测技术方法

DB32/T 4539-2023
ICS 13.020
CCS Z 06
江苏省地方标准
DB32/T 4539—2023

淡水生物环境DNA监测技术方法
Technical method for environmental DNA monitoring of freshwater organisms

2023-09-22 发布
2023-10-22 实施

江苏省市场监督管理局 发布
中国标准出版社 出版

目 次
1 范围
2 规范性引用文件
3 术语和定义
4 监测点位布设
5 监测频次与时间
6 试剂和材料
7 仪器和设备
8 环境DNA宏条形码监测内容和方法
9 质量控制与质量保证
10 废弃物处理
附录A（资料性）环境DNA固定剂
附录B（资料性）常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息
附录C（资料性）淡水生物DNA条形码构建方法
附录D（资料性）生物统计表
附录E（规范性）野外质量控制与保证
附录F（规范性）实验室质量控制与保证
参考文献

前 言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由江苏省生态环境厅提出并归口。
本文件起草单位：江苏省环境监测中心、南京大学。
本文件主要起草人：张咏、张效伟、杨雅楠、杨江华、蔡琨、王晨波、吕学研、李婧慧、张丽娟、钟文军、侍昊、朱晨、毛成责、卜亚谦、范帆。

1 范围

本文件规定了利用环境DNA技术监测淡水生物的采样、试剂和材料、仪器和设备、监测内容和步骤，以及质量控制与保证。
本文件适用于生态环境监测领域湖泊、水库、溪流、河流、河口区等水域浮游植物、浮游动物、着生藻类、大型底栖无脊椎动物和鱼类等淡水生物物种组成及相对丰度的监测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 20001.4 标准编写规则 第4部分：试验方法标准
GB/T 29859 生物信息学术语
GB/T 30989 高通量基因测序技术规程
GB/T 34265 Sanger法测序技术指南
GB/T 35890 高通量测序数据序列格式规范
GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则
GB/T 40226 环境微生物宏基因组检测
HJ 91.2 水质 采样技术指导
HJ 494 生物多样性观测技术导则
HJ 710.7 水生态监测技术指南 河流水生生物监测与评价（试行）
HJ 710.8 水生态监测技术指南 湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）
HJ 1216 高通量测序法 内陆水域鱼类
HJ 1295 淡水底栖大型无脊椎动物 浮游植物的测 0.1ml计数框-显微镜计数法
HJ 1296 生物多样性观测技术导则
SC/T 9402 淡水浮游生物调查技术规范
SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求
DB21/T 2777 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程
DB32/T 4178 河流水生态监测规范

3 术语和定义

GB/T 20001.4、GB/T 29859和GB/T 30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1
淡水生物 freshwater organisms
生活在各类淡水生境中的生物。
注：主要的淡水生物类群包括浮游植物、浮游动物、大型底栖无脊椎动物和鱼类等。

3.2
环境DNA environmental DNA; eDNA
环境介质（水、土壤、沉积物、生物膜、空气等）或混合生物组织中存在的脱氧核糖核酸（DNA）等生物遗传物质。

3.3
DNA条形码 DNA barcode
生物体细胞核或者细胞器中能够代表该物种的、有足够变异的、易扩增的短DNA序列，可用于物种的识别和鉴定。
【来源：SN/T 4278—2015, 3.1，有修改】

3.4
引物 primer
在DNA复制过程中，结合于模板链上并提供DNA合成起点，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。

3.5
聚合酶链式反应 polymerase chain reaction; PCR
一种体外酶促合成特异DNA片段的分子技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等组成一个周期循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。

3.6
Sanger测序 Sanger sequencing
用于基因测序的双脱氧末端终止法，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以A/T/G/C结束的四组不同长度的核苷酸链，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。

3.7
遗传距离 genetic distance
种群或分类单元间的遗传差异程度，可以通过遗传标记如DNA条形码的序列差异来表示。

3.8
高通量测序 high-throughput sequencing
区别于传统Sanger（双脱氧链末端终止法）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。
【来源：GB/T 30989—2014, 3.19，有修改】

3.9
16S核糖体DNA 16S ribosomal DNA; 16S rDNA
原核生物编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列。

3.10
18S核糖体DNA 18S ribosomal DNA; 18S rDNA
真核生物编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列。

3.11
线粒体12S核糖体DNA mitochondrial 12S ribosomal DNA; mt 12S rDNA
后生动物线粒体编码12S rRNA的DNA序列。

3.12
线粒体细胞色素c氧化酶I mitochondrial cytochrome c oxidase I; COI
后生动物线粒体编码细胞色素c氧化酶I的DNA序列。

3.13
DNA宏条形码 DNA metabarcoding
利用高通量测序获取环境DNA中特定的DNA片段，根据DNA序列差异识别物种，获取物种组成