【GA公共安全标准】 生物样品中敌鼠等六种抗凝血杀鼠剂的高效液相色谱检验方法

ICS13.310
中华人民共和国公共安全行业标准GA/T9322011
生物样品中敌鼠等六种抗凝血杀鼠剂的高效液相色谱检验方法
HPLC examination method for six anticoagulant rodenticides includingdiphacinoneinbiological samples2011-04-06发布
中华人民共和国公安部
2011-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草GA/T932—2011
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承扭识别这些专利的责任。本标准由北京市公安局法医检验鉴定中心提出。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析标准化分技术委员会（SAC/TC179/SC1）归口。
本标准起草单位：北京市公安局法医检验鉴定中心。本标准主要起草人杨士云，乔静、张大明、袁增平。TTKAONTKAca-
1范围
生物样品中敌鼠等六种抗凝血杀鼠剂的高效液相色谱检验方法
GA/T932—2011
本标准规定了生物样品中抗凝血杀鼠剂敌鼠、杀鼠灵、杀鼠迷、溴敌隆、大隆、杀它仗的高效液相色谱(HPLC)检验方法。
本标准适用于生物样品中敌鼠、杀鼠灵、杀鼠迷、漠敌隆、大隆、杀它仗的定性分析和定量分析，也适用于可疑毒饵等非生物样品。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T122毒物分析名词术语
3术语和定义
GA/T122界定的术语和定义适用于本文件。4原理
本方法采用在生物样品中加人内标物，经提取、净化、浓缩后，用具有二极管阵列检测器（DAD)的液相色谱测定其中的杀鼠剂。经与杀鼠剂标准品对照，以绝对保留时间RT值或相对保留时间RRT值及DAD光谱图作定性分析（相关色谱图和光谱图参见附录A）。定量分析时要同时取两份样品平行进行提取、进样，并与平行操作的对照标准品比较，以峰面积为依据，用内标法或外标法进行定量。5试剂及材料
5.1试剂
本方法所用试验用水为去离子水；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺为色谱纯；其他试剂为分析纯：a）磷酸盐缓冲液(0.025mol/L）：取磷酸氢二钾5.71g，磷酸二氢钾3.40g，溶于500mL去离子水中，用磷酸调pH为3，再用去离子水稀释至1000mL，b）2.0%离子对A水溶液：取2.0mL离子对色谱试剂IPR-A(主成分为十二烷基磺酸钠）溶于98mL去离子水中；
c）离子对A磷酸盐缓冲液：取30mL2.0%离子对A水溶液与10mL0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH=3）混合即可；
d）1.0%离子对A甲醇溶液：取1.0mL离子对色谱试剂IPR-A溶于99mL甲醇中；e）2.0%二甲基甲酰胺/离子对A甲醇溶液：取2.0mL二甲基甲酰胺溶于98mL1.0%离子对1
GA/T 932—2011
A甲醇溶液中；
f）15%甲醇乙腈溶剂：15mL甲醇与85mL乙腈混合；g）标准溶液：
1）标准储备液（1.0mg/mL）：准确称取敌鼠、杀鼠灵、杀鼠迷、溴敌隆、大隆、杀它仗、香豆素对照品各50.0mg，用甲醇溶解、定容至50mL。冰箱冷藏保存24个月；2）标准工作液（100.0μg/mL）：准确量取1.0mg/mL标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，加乙醇至刻度。冰箱冷藏保存12个月。h）0.06%三氟乙胺十0.06%三乙胺十0.25%乙腈水：分别吸取三氟乙胺0.6mL，三乙胺0.6mL，乙腈2.5mL于1000mL容量瓶中，加水至刻度5.2材料和仪器
5.2.1SiLicnGeL硅胶小柱（500mg，3mL）：使用时依次用3mL甲醇、3mL乙睛活化。5.2.2CN柱（500mg，2.8mL）：使用时依次用5mL甲醇、5mL水、5mL离子对A磷酸盐缓冲液活化。
旋涡震荡器。
容量瓶。
5.2.5具塞三角烧瓶。
5.2.6分液漏斗。
微量注射器。
5.2.8pH试纸（范围1~14)。
电子天平。
6检测
高速离心机。
HPLC：配备二极管阵列检测器(DAD)、在线自动脱气机、四元梯度淋洗装置、化学工作站。6.1定性分析
样品制备
取样量可根据实际情况进行调整，样品按以下参考方法制备：取液体样品1.0mL~2.0mL、固体样品（铰碎）1.0g~2.0g于10mL玻璃试管中，加人内标a）
香豆素10.0μg；
取空白液体样品1.0mL~2.0mL（固体样品1.0g~2.0g）于10mL玻璃试管中，做空白b)：
对照；
取空白液体样品1.0mL~2.0mL（同体样品1.0g~2.0g）于10mL玻璃试管中，添加标准c)
抗凝血杀鼠剂各10.0μg及内标香豆素10.0ug，做空白添加阳性对照。6.1.2样品提取
6.1.2.1非生物样品的提取
$2可疑鼠药毒饵，取毒饵1.0g于10mL离心管中，用2.0mL15%甲醇乙腈浸泡提取，离心后浓缩供分析；空杯、空饮料盒等样品，可直接用少量甲醇，乙酸乙酯等溶剂洗涤，收集洗涤液于蒸发血中，并浓缩至适量后离心供分析。
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6.1.2.2生物样品的提取
6.1.2.2.1血样的提取
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样品混匀，加人15%甲醇乙腈溶剂2mL，旋涡震荡3min～5min，离心，取出上清液，残渣用15%甲醇乙睛溶剂4mL分2次提取，离心，合并上清液，过已活化好的固相小柱，流速1.0mL/min，收集滤液，置于80℃水浴锅上浓缩至干，残渣用甲醇定容至0.1mL，离心，供分析。6.1.2.2.2胃内容、尿液的提取
样品混勾，用离子对A磷酸盐缓冲液稀释至6mL，过已活化好的CN小柱2次，流速1.0mL/min，之后用5mL离子对磷酸缓冲液洗柱，挤干水份，用2.0%二甲基甲酰胺/离子对A甲醇混合溶剂6mL洗脱，洗脱液浓缩，定容至0.5mL，离心，供分析。6.1.2.2.3肝、肾、肺样品的提取在样品中加pH=3的磷酸盐缓冲液0.5mL，混匀，加人2mL15%甲醇乙腈（杀它仗、大隆样品用甲醇：乙醛：乙腈混合溶剂提取，溶剂比例为1：1：8），旋涡震葛3min~5min，高心，取出上清液于10mL玻璃试管中，残渣再用4mL同样的溶剂分2次提取，离心并合并上清液于10mL玻璃试管中，过已活化好的SiLicaGeL硅胶小柱，流速1.0mL/min，挤出小柱内溶液浓缩，定容至0.5mL，离心，供分析。
6.1.3仪器检测
色谱参考条件：色谱柱为Hypersil.ODSC18(150mmX4.6mm，5μm）；或Luna-C18营（150mmX4.6mm，5μm）或同等柱；保护柱为C18(4mm×3.0mm,5μm）或同等柱。条件一：流动相为：A液：0.5%离子对A水溶液；B液：0.5%离子对A甲醇液，梯度洗脱程序B液起始为30%，2min升为50%，7min升为70%，9min升为100%，保持4min，返回到起始条件，流速1.0mL/min。DAD检测波长为31lnm，带宽16nm参考波长360nm，带宽100nm，柱温35℃。条件二：流动相为：A液：0.06%三氟乙胺十0.06%三乙胺十0.25%乙腈水溶液；B液：乙腈。梯度洗脱程序：B液起始为5%，15min为100%，18min为5%，流速1.0mL/min，DAD检测波长为230nm带宽16am参考波长360nm，带宽100nm，柱温35℃。6.1.4进样
分别吸取样品提取液、空白对照提取液和已知标准液各10.0μL，按上述色谱条件进行分析，每个样品进样2～3次。
6.1.5记录和计算
记录抗凝血标准品、内标标准品和样品中可疑杀鼠剂、内标的保留时间，峰面积值及DAD光谱图的最大吸收，按公式(1)计算回收率。R=会×100%
式中：
添加杀鼠剂或内标的回收率；bzxz.net
AB—一空白添加样品中杀鼠剂或内标的峰面积平均值；As—等量杀鼠剂标准品或内标的峰面积平均值，（1）
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6.2定量分析
6.2.1样品提取
准确量取液体样品1.0mL(或固体样品1.0g）各两份，加人内标香豆素10.0μg；另取相应的空白样品两份，分别加人杀鼠剂10.0μg、内标香豆素10.0μg。按6.1.2中相应的操作进行。6.2.2仪器测定
色谱条件同6.1.3.
6.2.3进样
分别吸取样品提取液、空白添加样品提取液各10.0μL，按6.1.3规定的色谱条件进行分析，每个样品各进样2~3次。
6.2.4记录和计算
6.2.4.1内标法
记录样品及空白添加标准品中抗凝血杀鼠剂峰面积值、内标峰面积值，计算样品及空白添加标准品中抗凝血杀鼠剂峰面积平均值，内标峰面积平均值。按公式（2)计算样品中抗凝血杀鼠剂的合量。其中校正因子用公式(3)计算。
式中：
式中：
W=fxAXm
样品中杀鼠剂含量，单位为微克每克（μg/g)或微克每毫升（μg/mL）；杀鼠剂峰面积；
内标物添加量，单位为微克(g)；内标物峰面积；
样品用量，单位为克（g）或毫升（mL）：校正因子。
M×A内
M×A标
杀鼠剂标准液进样量，单位为微克（ug)；标准液中杀鼠剂峰面积；
内标物标准液进样量，单位为微克(μg)；标准液中内标物峰面积。
6.2.4.2外标法
·（2)
（3）
记录样品及空白添加标准品中抗凝血杀鼠剂峰面积值，计算样品及空白添加标准品中抗凝血杀鼠剂峰面积平均值。按公式(4)计算样品中抗凝血杀鼠剂的含量。W
式中：
MXA粒
MXA标
检材中杀鼠剂含量，单位为微克每克（μg/g）或微克每毫升（μg/mL）；空白添加中杀鼠剂的添加量，单位为微克（ug)；iiKAoNiKAca
（4）
检材提取液中杀鼠剂的峰面积；M
检材量，单位为克(g)或毫升(mL)；A空白添加中杀鼠剂的峰面积。
6.2.4.3计算相对相差
记录两份平行操作的检材含量，按照公式(5)计算相对相差。RD=LXXl×100%
式中：
相对相差：
X、X，--两个样品平行定量测定的含量数值；A
7结果评价
一两个样品平行定量测定含量的平均值。7.1定性结果评价
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（5）
7.1.1如果添加于样品中的杀鼠剂或内标物回收率在60%以上，样品中末出现此类杀鼠剂的色谱峰，可认为样品中不含此类杀鼠剂，阴性结果可靠。如果回收率在60%以下，样品中未出现此类杀鼠剂的色谱峰，则操作有误，阴性结果不可靠，应重新试验。不同固相萃取柱获得的回收率参见附录B。7.1.2若样品中出现与此类杀鼠剂相同的RT和RRT值及DAD光谱图，应重新选择条件进行分析，结果均一致时，可判断样品中含有此类杀鼠剂。血中杀鼠剂的最小检出限参见附录C。7.1.3如果空白样品中不出现此类杀鼠剂的色谱峰，而样品有相应的色谱峰，说明空白无干扰，阳性结果可靠。如果空白中也出现此类杀鼠剂的色谱峰，则阳性结果不可靠，应重新选择条件进行分析。7.2定量结果评价
两份样品测定结果的相对相差若不超过20%，结果按两份样品含量的平均值计算。如果相对相差超过20%，需要重新进行测定。
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附录A
（资料性附录）
六种杀鼠剂的相关色谱图和光谱图A.1六种杀鼠剂及内标香豆素的色谱图，见图A.1。mAUj
注：色谱峰1为香豆素；2为杀鼠灵，3为杀鼠迷；4为敌鼠，5、6为漠敌隆，7为杀它仗，8为大隆。图A.16种杀鼠剂及内标香豆素的色谱图A.2六种杀鼠剂及内标香豆素的光谱图，见图A.2～图A.8.mAU
香豆素DAD光谱图
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杀鼠灵DAD光谱图
杀鼠迷DAD光谱图
敌鼠DAD光谱图
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GA/T932—2011
溴敌隆DAD光谱图
杀它仗DAD光谱图
大隆DAD光谱图
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附录B
（资料性附录）
固相萃取方法的回收率
B.1针对不同检材采用不同固相萃取柱获得的回收率数据，见表B.1~~表B.4。GA/T 932—2011
表B.1SiLicaGeL小柱提取的回收率（1mL血添加10pg杀鼠剂）回收率/%
香豆素
杀鼠灵
杀鼠迷
滨敌隆
杀它仗
茶鼠灵
杀鼠述
溴敌璧
茶它仗
香豆素
杀鼠灵
杀鼠迷
隐敌隆
平均回收率/
CN小柱提取的回收率（2mL尿添加10μg杀鼠剂）回收率/%
平均回收率/
SiLicaGeL小柱提取杀鼠灵等四种杀鼠剂的回收率（1g肝添加10μg杀鼠剂）回收率/%
注：以15%甲醇乙为提取液。
平均回收率/
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表B.4SiLicaGeL小柱提取杀它仗、大隆的回收率（1g肝添加10μg杀鼠剂）回收率/%
香豆素
杀它仗
注1：杀它仗回收率是以其毒饵提取物为标准所做的回收率。注2：以甲醇：乙醛：乙睛混合溶剂（比例为1：1：8）提取。10
ikAoNiKAca
平均回收率/
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