【GA公共安全标准】 法庭科学毛发、血液中氯胺酮气相色谱和气相色谱-质谱检验方法

ICS13.310
中华人民共和国公共安全行业标准GA/T1316—2016
法庭科学毛发、血液中氯胺酮气相色谱和气相色谱-质谱检验方法
GC and GC-MS examination methods for ketamine in hair and bloodsamples of forensic science
2016-06-30发布
中华人民共和国公安部
2016-06-30实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GA/T1316-2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC179/SC1）提出并归口。
本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、上海市公安局物证鉴定中心。本标准主要起草人：朱军、刘耀、于忠山、常靖、崔魏巍、张玉荣、汪蓉。I
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1范围
法庭料学毛发、血液中氨胺酮气相色谱和气相色谱-质谱检验方法
GA/T1316—2016
本标准规定了法庭科学毛发、血液中氯胺酮的气相色谱(GC)和气相色谱-质谱（GC-MS)检验方法。本标准适用于法庭科学毛发、血液中氯胺酮的定性和定量分析。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GA/T122毒物分析名词术语
3术语和定义
GA/T122界定的术语和定义适用于本文件。4原理
以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对毛发，血液样品进行提取，净化、浓缩或衍生化后，用GC，GC-MS进行检别，以保留时间R）、质谱特征离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据：用标准曲线法进行定量分析，或与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰面积之比，用外标法或内标法进行定量分析。
5试剂仪器及材料
5.1试剂
本法所用试剂均为分析纯，试验用水为三级水（见GB/T6682一2008规定）：a）盐酸氨胺酮
b）内标4-苯基丁胺（4-PBA)或其他等效内标物：c）甲醇；
d）环已烷；
e）二氯甲烷；
乙酸乙酯；
异丙醇；
氨水；
磷酸二氢钾；
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磷酸氢二钠；
k）氢氧化钠；
1）浓盐酸；
m）乙酸；
n）葡萄糖醛酸酶：
o）芳基硫酸酯酶；
P）可溯源标准物质溶液：分别配制氯胺酮、内标4-PBA或其他合适内标物1.0mg/mL的单一标准甲醇储备溶液。密封，置于冰箱中冷冻保存。保存时间6个月：q）单一标准工作溶液：
1）0.10mg/mL单一标准工作溶液：分别移取氯胺酮、内标4-PBA的可溯源标准物质溶液1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.10mg/mL氯胺酮和0.10mg/mL内标4-PBA，密封，置于冰箱中冷冻保存。保存时间3个月：2）分别取0.10mg/mL氯胺酮和0.10mg/mL内标4-PBA单一标准工作溶液0.2mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成2μg/mL的氯胺酮单一工作溶液，保存时间1天。
r）混合标准工作溶液：移取氯胺酮的可溯源标准物质溶液1mL内标4-PBA的可溯源标准物质溶液2mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.10mg/mL氯胺酮和0.2mg/mL内标4-PBA，密封，置于冰箱中冷冻保存。保存时间1个月；葡萄糖醛酸酶（12单位/mL）/芳基硫酸酯酶（60单位/mL）：12单位的葡萄糖醛酸酶与60单s)
位芳基硫酸酯酶混合配制于1mL的水中；t）1mol/LNaOH溶液：称取4.0g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100mL；u）0.1mol/LHCl溶液：量取8.3mL浓盐酸，用水稀释至1000mL；v）二氯甲烷/异丙醇/氨水（体积分数比为7820：2）混和溶剂w）1%酸性甲醇液：量取1mL浓盐酸，用甲醇稀释至100mL；x）1mol/L乙酸溶液：量取5.9mL乙酸，用水稀释至100mLy）pH=7.6磷酸盐缓冲液：
1）0.133mol/LNazHPO,溶液配制：35.76gNazHPO,7HO或18.89g无水NagHPO溶于1L水中；
2）0.133mol/LKHzPO.溶液配制：9.08gKH,PO,溶于0.5L水中；pH=7.6磷酸盐缓冲液：0.133mol/LNazHPO,溶液86.8mL与0.133mol/LKHPO3）
溶液13.2mL混合即得。
注：0.133mol/LNaHPO.溶液与0.133mol/LKHzPO.溶液分别储存，临用前混配。z）0.1mol/LKH,PO.缓冲液（pH=6.0):10mL0.2mol/LKHzPO.与1.14mL0.2mol/LNaOH混勾，加水稀释至29mL，用0.1mol/LNaOH溶液或0.1mol/LHCl溶液调至pH=6.0即可，
aa）20%NaOH溶液：称取20gNaOH溶解于80mL水中；bb）三氟乙酸酐（TFAA）。
5.2仪器与材料
使用的仪器与材料如下：
a）配氮磷检测器（NPD）的气相色谱仪；b）配电子轰击离子源（EI)的气相色谱-质谱联用仪；电子天平：分度值为0.1mg；
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涡旋振荡器：
高速离心机：转速8000r/min以上：超声波清洗器；
移液器：
浓缩器：
烘箱；
微波炉；
空白人体毛发：500mg
空白人体血液：500mL：
m）混合阳离子交换（MCX)固相萃取柱或等效柱：具盖塑料试管：15mL；
具塞玻璃试管：10mL；
微量注射器：10μL；
塑料尖底离心管：15mL。
6检验
6.1定性分析
6.1.1毛发检验
6.1.1.1毛发清洗
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拔取（死后）或尽量紧贴皮肤剪取（活体）毛发0.3g～1.0g。将毛发剪成长约2cm碎段，取约100mg置小烧杯中，依次用10mL二氯甲烷，10mL水，10mL二氯甲烷各超声2min，自然晾干，于干净塑料袋内密封后保存。同时，收集最后清洗毛发的二氧甲烷溶液，在浓缩器上45C下浓缩至干后经GC或GC-MS进行毒品检验，结果呈阴性证明毛发外部无污染，否则重新清洗毛发，直至最后清洗溶液毒品检验呈阴性。
6.1.1.2毛发水解
6.1.1.2.1酶水解
将洗干净的毛发剪碎至1mm2mm左右，称取30mg，加人0.10mg/mL4-PBA内标液10μL，加人pH=7.6磷酸盐缓冲液2mL，75μL葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶溶液，置于烘箱内40℃保温2h。
6.1.1.2.2酸水解
将洗干净的毛发剪碎至1mm2mm左右，称取30mg，加人内标0.10mg/mL4-PBA内标液10μL加人0.1mol/LHCl溶液1mL，置于烘箱内90℃保温2h～3h。6.1.1.2.3碱水解
将洗干净的毛发剪碎至1mm~2mm左右，称取剪碎的毛发30mg，加人内标0.10mg/mL4-PBA内标液10μL，加人1mol/LNaOH溶液1mL，置于烘箱内100C保温15min6.1.1.3提取方法
酶或酸水解后的毛发冷却至室温，加20%NaOH调pH>11（碱水解后的毛发不用调pH值，直接3
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提取），用2.5mL乙酸乙酯提取，振荡10min，8000r/min离心10min，提取有机相；再重复提取一次。合并两次提取的有机相，加人20μL含1%盐酸的甲醇液，在浓缩器上45℃下浓缩至干。6.1.1.4衍生化
用30μL乙酸乙酯溶解6.1.1.3的提取物，加人30μL三氟乙酸酐，在微波炉功率为450W下加热2min，或于烘箱内60C加热30min，在浓缩器上45℃下浓缩至干，用50μL甲醇溶解定容，供仪器分析。
当样品中毒品含量较低时，可适当加大样品用量。6.1.1.5添加样品及空白样品
取空白毛发30mg两份，一份添加0.10mg/mL4-PBA内标液10μL和2μg/mL的氯胺酮标准品溶液30μL（每毫克毛发添加2ng氧胺酮）作为检测限添加样品，一份做空白样品，与样品毛发平行提取和分析。
6.1.2血液检验
6.1.2.1液液萃取
取血液样品1mL于试管中，加人0.10mg/mL4-PBA内标液20μL，加人20%的NaOH溶液200μL，混匀，加人6mL环已烷，振荡5min，8000r/min离心5min后，移取有机相于玻璃试管中，加30μL1%酸性甲醇液，在浓缩器上40℃C下浓缩至干。对于毒品含量较高的血液样品，可不经衍生化，直接用50L甲醇定容，供仪器分析。
6.1.2.2固相萃取（MCX固相萃取柱的参考提取条件）6.1.2.2.1血样处理
移取血液样品1mL于试管中，加人0.10mg/mL4-PBA内标液20μL，加水稀释4倍，8000r/min离心10min，取上清液，加2mL0.1mol/LKHzPO.缓冲液（pH=6.0），混匀，待上固相萃取柱。6.1.2.2.2固相萃取（MCX固相萃取柱的参考提取条件）固相萃取柱依次用2mL甲醇，2mL0.1mol/LKHzPO，缓冲液（pH=6.0)活化后，将处理后的血液样品加载过柱，依次用1.0mol/L乙酸溶液1mL，水3mL淋洗，抽干小柱，再用6mL甲醇淋洗，抽干小柱，用3mL体积比为78：20：2的二氯甲烷/异丙醇/氨水混和溶剂洗脱，洗脱液在浓缩器上40℃下浓缩至干。活化、上样和洗脱流速均控制在0.5mL/min～1.0mL/min。对于毒品含量较高的血液样品，可不经衍生化，直接用50L甲醇定容，供仪器分析。采用其他等效柱提取，操作步骤参照说明书进行。6.1.2.3衍生化
用30μL乙酸乙酯溶解6.1.2.1或6.1.2.2的提取物，加人30μL三氟乙酸酐，在微波炉功率为450W下加热2min，或置于烘箱60C加热30min，在浓缩器上45℃下浓缩至干，用50μL甲醇溶解定容，供仪器分析。
当样品中毒品含量较低时，可适当加大样品用量。6.1.2.4添加样品及空白样品
移取空白血液1mL两份，一份添加0.10mg/mL4-PBA内标液20μL和一定合适量的氯胺酮标准品作为检测限添加样品，一份做空白样品，与样品血液平行提取和分析。4
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6.1.3分析参考条件
6.1.3.1气相色谱仪分析条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同性状样品实际情况进行调整：GA/T1316-—2016
a）色谱柱：DB-5毛细柱（或其他5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷等效柱），30m×0.25mm×0.25μm
注：DB-5柱和DB-5MS柱均为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。色谱柱温程：170C保持1min，以10℃/min速率升温至230℃，保持10min，以30℃/minb)
速率升温至280C，保持7min
进样口温度：280℃；
检测器温度：280C；
载气：高纯N2；
柱流量：1mL/min；
分流比：15：1（可根据样品情况作适当调整）；检测器：NPD（氨磷检测器）；
NPD检测器气体流速：空气175mL/min，氢气4.0mL/min，尾吹25mL/min。气相色谱-质谱联用仪分析条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同性状样品实际情况进行调整：色谱柱：DB-5MS毛细柱（或5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷等效柱），30m×0.25mm×a)
注：DB-5MS柱为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。色谱柱温程：80C保持2min，以30C/min速率升温至280℃，保持16.5min；b)
溶剂延迟时间：3min；
进样口温度：280℃：
传输线：250C；
离子源温度：230℃
载气：高纯He;
柱流量：1mL/min；
分流比：5：1（可根据样品情况作适当调整）；EI源电子能量：70eV：
质谱扫描范围：40amu450amu
扫描方式：全扫描（SCAN)或选择离子模式（SIM）；检测目标物质谱特征峰见表1。
表1检测目标物质谱特征峰
检测目标物名称
氯胺酮
内标4-PBA
氯胺酮-TFA衍生物
内标4-PBA-TFA衍生物
质谱特征峰
m/z180（基蜂），m/z209、m/z152m/z45（基峰）、m/z91.m/z132
m/z110（基峰），m/z270.m/z236m/z91(基峰）.m/z104,m/z176
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6.1.4样品分析
分别移取各样品提取（浓缩）衍生液，空白样品提取（浓缩）衍生液、标准品衍生液各1.0μL，按6.1.3色谱分析条件进样分析。
6.1.5记录及计算
记录各样品及标准品平行进样23次的保留时间及峰面积值，按式（1)计算回收率：Az×Wn×V=×100%
式中：
R—外标或内标的回收率；
一添加样品中标准物质或内标物峰面积平均值；A吨一等量标准物质或内标物纯品的峰面积平均值；M一一添加样品中标准物质或内标物添加量，单位为微克（μg）：V添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）；W一标准物质或内标物浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）。6.2定量分析bzxz.net
6.2.1毛发样品提取
中noteaoe**(1）
称取样品毛发30mg两份，分别添加0.10mg/mL4-PBA内标液10μL，混勾，按6.1.1~6.1.4平行提取。当样品中毒品含量较低时，可适当加大样品用量。称取空白毛发30mg两份，分别添加0.10mg/mL4-PBA内标液10μL和450ng氯胺酮标准品（每毫克毛发添加15ng氯胺副），混匀，作为定量添加样品按6.1.1~6.1.4平行提取。6.2.2血液样品提取
移取样品血样1.0mL两份，分别添加0.10mg/mL4-PBA内标液20uL，混匀，按6.1.1或6.1.2方法平行提取和6.1.3方法平行衍生化。当样品中毒品含量较低时，可适当加大样品用量。移取空白血样1.0mL两份，分别添加0.10mg/mL4-PBA内标液20μL和1.0μg氯胺酮标准品，混勾，作为定量添加样品按6.1.1或6.1.2方法平行提取和6.1.3方法平行衍生化。6.2.3仪器检测
分别移取各毛发或血液样品提取（浓缩）衍生液、添加样品提取（浓缩）衍生液、标准品衔生液各1.0L，按6.1.3色谱分析条件每个样品进样分析2次～3次。6.2.4记录
记录样品，标准品及内标物峰面积（峰高）值，计算各试样峰面积平均值，然后计算含量。6.2.5计算
6.2.5.1外标法计算公式
记录各样品平行进样2次～3次中目标物质的峰面积值，按式（2)计算含量：W=A#×M×V#
+.（2）
式中：
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单位质量样品中目标物质含量，单位为微克每克（μg/g）或微克每毫升（μug/mL）：A
样品中目标物质平均峰面积：
一添加样品中标准物质平均峰面积：M—添加样品中标准物质添加量，单位为微克（ug）；M群
-样品量，单位为克（g）或毫升（mL）；V添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）；V一样品的定容体积，单位为毫升（mL）。6.2.5.2内标法计算公式
记录各样品平行进样2次～3次的目标物及内标物保留时间和峰面积值，按式（3）计算校正因子，按式（4)计算含量：
M标XA肉
MXA标
式中：
校正因子；
M标目标物添加量，单位为微克（μg）：A内——内标物添加峰面积；
式中：
内标物添加量，单位为微克（μg）；目标物添加峰面积。
W=f×A#×Mx×Vm
AXM#XV样
单位质量样品中目标物质含量，单位为微克每克（μg/g）或微克每毫升（μg/mL）；校正因子；
样品中目标物质平均峰面积；
添加样品中标准物质平均峰面积：-添加样品中标准物质添加量，单位为微克（ug）：样品量，单位为克（g）或毫升（mL）；添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）；样品的定容体积，单位为毫升（mL）。相对相差计算公式
记录2份平行操作的案件样品含量，按式（5)计算相对相差：RD=LXi-X,l
式中：
相对相差（%）；
两个样品平行定量测定的含量数值；两个样品平行定量测定含量的平均值。（3）
+（4）
（5）
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7分析结果评价
7.1定性结果评价
7.1.1阴性结果评价
如果案件样品中未出现与氯胺酮标准品或其衍生物t值相同的色谱蜂，且氯胺酮添加样品的回收率大于或等于60%，则阴性结果可靠。如果氯胺酮添加样品中未出现与氯胺酮标准品或其衍生物tR值相同的色谱峰或回收率小于60%，则阴性结果不可靠，应按6.1重新提取检验。7.1.2阳性结果评价
如果案件样品中出现与氯胺酮标准品或其衍生物t值相同的色谱峰，且质谱特征离子碎片及相对丰度一致，空白样品无干扰，则阳性结果可靠。如果空白样品中出现与氯胺酮标准品或其衍生物t值相同的色谱峰，且质谱特征离子碎片及相对丰度一致，则阳性结果不可靠，应按6.1重新提取检验。7.2定量结果评价
如果样品中目标物含量的RD大于20%，定量数据不可靠。如果目标物含量的RD小于或等于20%，定量数据不可靠，应按6.2重新提取检验。7.3相关资料
本方法添加实验参数及范围参见附录A，相关色谱图参见附录B。8
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