【GA公共安全标准】 中毒检材中巴比妥类药物的定性定量分析方法

中华人民共和国公共安全行业标准GA/T102-1995
中毒检材中巴比妥类药物的
定性定量分析方法
Methods of qualitative and quantitative anal ysisfor barbiturates in case samples1995-06-12发布
中华人民共和国公安部发布
1997-01-01实施
中华人民共和国公共安全行业标准中毒检材中巴比要类药物的
定性定量分析方法
Methods of qualitative and quantitative analysisfor barbiturates in case samples1主题内容与适用范围
本标准划定了中事检材巴比要类药物的检验方法GA/T102—1995
本标准适用于中毒检材中的巴比妥，萃巴比要，速可眠，戊巴比要，异戊巴比妥，硫喷妥及其他化学结构相似的巴比要类药物的定性，定量分析。2引用标准
GA/T122-1995牵物分析名词术语3定义
本标准定义采用GA/T122—1995标准中的定义。第一篇气相色谱法
本标准可提供的检材有：中毒者的血，尿，中毒死亡者的血，肝，尿，肾，脑，胆汁，胃及胃内容物等：对怀疑注射入体内者，还需提供注射部位肌肉。凡有现场的还需提供现场收集坏疑含有药物的物证。4原理
本方法系采用在生物检材中加人内标药物经提取，净化，依缩后，用具有火烙离子化检测器（FID）或氧磷检测器（NPD）的气相色谱仪测其中药物。经与本组药物标准品对照，以绝对保留时间RT值或相对保留时间RR工值作定性分析。与平行操作的对照标准品比较，以峰面积为依据，用内标法进行定量。乱确检测器比火馅离子化检测器具有较高的灵敏度，可用来分析含治疗量以下的生物检材中的巴比要类药物。
在相同色谐条件下，巴比要类药物的甲基衔生物的灵敏度高于原体药物，对生物检材中巴比妥类药物可进行衍生化后再分析其衔生物。5试剂
所有试剂，均为分析纯。
5.1无水乙醇
5.2浓盐酸
5.3乙醚
中华人民共和国公安部1995-06-12批准1997-01-01实施
5.4氧仿
5.5无水硫酸钠
GA/T102-1995
5.60.45mol/L氢氧化钠：将9g氢氧化钠用蒸馅水溶解，置500mL容量瓶中，稀释至刻度。5.76mol/L盐酸
5.8三级活度中性层析氧化铝取市售中性层析氧化铝于130C烘箱中烘3~4h，冷后立即按6%比例加蒸增水境拌巧匀，散回原瓶中备用。5.9层析用颗粒活性碳0.43~0.5mm或20~40目5.10单一药物标准储备溶液：精密称取巴比妥类各种药标准品100mg+分别于10mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，得每毫升含10tmg药物的标准液，置一10C冰箱中保存。该液可使用一年。
5.11单一药物标准使用液精密量取单一药物标准储备液巴比要、异戊比妥、戊巴比要、速可眠，硫喷妥要各1mL，萃巴比妥2mL分别移入10mL容量瓶中，各加无水乙醇至刻度，混匀，得每毫升乙醇各含1mg巴比要，异皮巴比要、速可眠.硫喷妥、戊巴比要及2mg苯巴比要的标准使用液，置4℃冰箱中保存。该溶液可使用半年。
5.12混合药物标准使用液各取单一药物标准储备液巴比妥，异戊巴比妥、速可眠，硫喷要各1mL，苯巴比妥标准溶液2mL于同一个10mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀，得每毫升乙醇液含萃巴比要2mg，其他巴比要类药物各1mg混合的标准使用液。该溶液可使用半年。5.13内标物标准溶液精密称取内标物烯丙异丙巴比要（Aprobarbital)100mg于10mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，混匀。得每毫升乙醇液含内标物10mg的标准贮备液。混匀，置4℃冰箱中保存。5.14内标物标准使用液精密量取内标物标准溶液1mL于10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，混匀。得每毫升含内标物1mg的使用液，置4C冰箱中保存。该溶液可使用半年。5.15pH9碳酸钠液：25g碳酸钠溶于100mL蒸馏水中5.16硫酸二甲酯（此试剂为刺意性有毒液体，使用时不得外溢）。5.17四氣化碳
6.1气相色谱仅：具有火焙离子化检测器(FID)及氮磷检测器(NPD)，和色谱数据处理机。6.2电动振劳器
6.3K.D浓缩器
6.4台式通用旋竭振药器
6.5水浴锅
6.6微量注射器10mL，100pL
7操作方法
7.1定性分析
7.1.1提取取检血5mL、尿10mL、胆汁5mL及胃内容物、绞碎的肝，胃、肾，脑等组织各5g分别放于100mL具塞三角烧瓶中，各加人内标物标准使用液100μL（含100μg内标物），混匀。另取一份相应的空白脏器作空白对照，在上述样品中（尿，胆汁除外）各加人5mL无水乙醇，充分振摇使蛋白发生絮状沉淀，再加6mol/L盐酸调节酸度至pH2，用乙醚50mL振荡提取15min，静置澄清后，分出乙醛于另一三角瓶中或缓慢倒入已填装好的净化柱中。残渣再用乙醒30mL，握播提取15min，再分出乙醛。7.1.2净化及浓缩
7.1.2.1装柱取长约2030cm内径约1.5cm下口具活塞的玻璃层析柱（也可用50mL分液漏斗代替）。于底层松松塞上少许脱脂棉，依改装人无水硫酸钠2~3g.三级活度中性层析氧化铝1015g·如遇2
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肝组织检材或具有色素检液再加活性碳0.5g，顶层加无水硫酸销10g7.1.2.2淋洗用20mL乙醛顶淋装好的柱子（注意预淋时勿使柱中无水硫酸钠表层干润），然后将7.1.1步第一次提取液倒入柱中，特第一次提取液刷流完时，再倒入第二次提取液，用活塞控制流速，以一滴接一滴流出淋洗液为宜，特第二次乙酵提取液刷流完时，用20mL乙醛洗脱柱子。全部过柱后的乙醚液收巢于100mL分液漏斗中。
7.1.2.3用5mL0.45mol/L氢氧化液反提乙醚共二次，每次振荡5min+合并氢氧化钠反提液，再用6M盐酸调节至pH2，用10mL就仿分两次提取上连酸液，每次振药5min，放置避清后，分出载仿经无水硫酸钠脱水后，将氧仿置K.D浓缩器中于70C浓缩至干（或用N吹或自然挥干），再加100μL乙醇溶解，供分析用。
7.1.3分析条件参号值
色谱柱：获请柱内径3mm.长2.0m检测器：火络离子化检测器（FID）固定液及担体：3%OV-17涂于80~100日目ChromosorbWHP上。温度：
柱温：210℃
检测器温：260℃
汽化室温：260℃
气体流速：
空气：
空气与氢气比应按各厂家仅器选择最佳条件。7.1.4检测方法一
7.1.4.1进样
将各种检材提取浓缩液及空白对照提取依缩液1~3pL注人上述条件色谐仪中，每个样品进样2~3次，并注入单一药物标准品使用液及等量内标物标准使用液。7.1.4.2记录
分别记录各检材中内标物及药物的保鼠（RT）值，填入GC定性分析结果表中（见通用标准），并记录添加于检材中内标物及等量内标物标准使用液在相同条件下的蜂面积值。7.1.4.3计算
计算各药物标准品及检材中各药物保留时间（RT）平均值，以内标RT值为1，计算各药物RRT平均值，填入上述表中。
计算内标物的回收率
检材中内标物峰面积平均值
内标物回收率（%）一
零量丙标物标准液峰面积草玛值×1007.1.5检测方法二
衍生化方法
7.1.5.1衔生化操作过程
将上述检材提取液及混合药物标准使用液用N，气吹干，各加人PH9碳酸钠减1mL，再各加人0.1mL硫醒二甲脂行生化试剂，充分程合，并在70C水浴中加热15秒，振摇，再加热使二液层消失取出放冷，于各管中加人100L四氧化碳，充分振插后离心或静置使其分层（此时巴比要类药物衔生物已转人四享化限中吸取上层绝大部分水减弃去，留下CC层。7.1.5.2进样
各取检材提取液及混合药物标准使用减的衔生物四氧化碳减1L，按7.1.3分析巴比要类药物的3
GC条件进行分析，各进样23次。7.1.5.3记录及计算
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分别记录各检材中内标物及药物保留时间值（RT）值，填人记录表中。并以烯丙异丙巴比要RT值为1，计算各种药物的RRT值。
巴比安类各种药物及甲基衔衍生物的色谱图及RT值，RRT值见附录A。7.2定量分析
7.2.1提取
精密量（杯）取检血5mL使辞的开等组织5g共二份（精确至0.01），放在100mL具笔三角瓶中，另以相对应的空白组织样品一份，款在100mL具塞三角烧瓶中，向其中添加待测药物各50100ug（根据含量定），作定量标准对照。向检材及空白添加样品中各加入内标物标准使用液100μL。以下按7.1.1*各加人5mL无水乙醇起依次操作。7.2.2净化及浓缩
按7.1.2项依达操作。
7.2.3分析条件
按7.1.3项条件进行。
7.2.4测定方法
7.2.4.1进样
将两份检材提取装缩准及一份举加标准品提取依缩波分别进样，根据其含量每种检材进样1一3pL各进样2~3次。
7.2.42记录
记录检材及空白添加标准品中各待测药物及内标物峰面积值，填人GC定量分析记录表，井算出各检材中内标物及药物的平均峰面积值。7.2.5计算分析结果
7.2.5.1计算相对校正因子厂
添加于空白中待测药物进样量（些）内标物蜂面积平均值于一蒸加子空者甲内标物进样量（a)X空白中得测药物峰面积平药值：7.2.5.2计算检材中药物含量
检材中药物含量 W(mg/10g)= x检材中待测药物峰面积平均值X内标添加量(μg)×100检材中内标峰面积平均值×检材重量g）×10007.2.5.3计算相对相差
相对相差(%)=1×100
式中：X1.X，为两份检材平行定量测定的数值。8结果评价
8.1定性分析结果评价
8.1.1如果添加于检材中的内标物婚丙异丙巴比要回收率在60%以上，检材未出现相应的巴比要类药物色谐峰，可认为橙材中不含巴比要免药物，阴性结果可靠。如果内标物回收率在60%以下，检材来出现相应巴比要英药物的色谐，居集作有误，阴性结果不可靠，应重新实验。8.1.2检材中若出现相应的巴比要类药物色谱蜂，可根据RT和RRT值并重选分析条件，结果均一致时，可以判新检材中含有某种巴比要类药物。8.1.3如果空白胜器经提取后未出现巴比要类相应的色谐峰，则检材有相应色谐蜂时，说明空白无干优，阳生结果可靠，如果空白脏器出现有巴比要类相应的色语壁，空白有干优，即使检材有相应色峰结果也不可靠，应用其他方法验证。8.2定量分析结果评价
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定量分析时，同一检材的两份样品中，百分含量的相对相差不超过20%时，其结果接二个样品平均值计算，如果相对相差超过20%，其结果不精确，应重新实验。第二篇紫外分光光度法
9原理
生物检材中的巴比要类药物提取，净化后，用紫外分光光度仅测定药物案外吸收特征，根据最大，量小吸收波长特征可对同类药物进行筛选。在波长260nm处，根据被测药物在pH10和pH14（硫喷除外）两种不同介质中，测得的吸收差值，用平行提取的同类药物标准品进行比较进行定量分析。10试剂
10.110.11同5.5~5.11
10.12精洗乙醚：取市售分析纯乙醛100mL用0.45mol/L氢氧化钠液5mL提取，放出碱液，在索外分光光度仅200~350mm测要收特征，合格乙醛应在220mm波长以后无最大吸收，如有吸收，取500mL乙酵置于1000mL分液漏斗中，加3%氢氧化钠30~40mL振摇洗10min，放置弃去碱液，再用40mL蒸馆水洗两道，弃取水，乙醚通过无水硫酸钠脱水即得。10.130.6mol/L码酸一氧化钾缓冲液：精确称取硼酸18.55g和氧化钾22.36g，用蒸馅水加热溶鲜后，置于500mL容量瓶中，加水稀释至刻度。11仅器
11.1紫外分光光度仪
11.2电动振劳器
11.310gL.100pL微量注射器
12操作方法
12.1筛选试验
12.1.1提取
取检材5g（mL）和相应的空白脏器5g二份，分别放人100mL具塞三角烧瓶中，在其中一份空白中加人巴比妥类的一种药物100g（如速可眠）作阳性对照，另一份作空白参比液用，在以上三份样品中各加入5mL无水乙醇，充分振摇以沉淀蛋白，使组织成案状，再滴加6mol/L盐酸至pH2，用乙醛50mL，30mL提取两次，每次瓶满1015min，放置澄清，分别分离出乙醛。12.1.2净化
过净化柱，方法同7.1.2过柱净化后的乙醚液收集于分液漏斗中，各用5mL0.45mol/L氢氧化销液提取两次，合并的提取液于小烧杯中心12.1.3测试液的配制
取检材，添加和空白对照样品提取液各2mL，每个取2份，其中一份中加2mL0.45mol/L，氢氧化钠液使pH为14，另一份加2mL0.6mol/L翻酸一氧化钾缓冲液使pH为10另取添加在空白中相同的药物标准品100μg于烧杯中，挥去乙醇液，加10mL0.45mol/L氢氧化钠液溶解，并按此法分别配制成PH14和pH10的落液各4mL，另取二个小烧杯，其中一十加4mL0.45mol/L氢氧化钠液，另一十加2mL0.45mol/L氢氧化销液和2mL0.6mol/L辅酸一氧化钾缓冲液pH值分别为14和10，作为参比溶液。
12.1.4检测
上述各样品的pH14和pHI0的检液以pH14和pHI0落液作参比，放在3mL石英池中，在波长GA/T102-1995
200nm至350nm测紫外吸收特征。如pH14液在255nm有吸收?pH10液在240nm有吸收，面且约在250mm处相交，可能存在5.5一取代巴比妥类药物（即巴比妥，速可眠、戊巴比要和异戊巴比要、萃巴比妥）.如pH14液在305nm左右有吸收，将检材对照溶液加浓H,SO.12滴呈pH2.并用pH2酸液作参比再测案外吸收，如在288nm左右处有吸收特征，可能为硫喷要。其紫外吸收图见附录A
12.2定量分析
12.2.1提取，净化
取检材5g（mL）二份，相对应空白脏器二份，其中一份添加待测药物100pg，另一份作空白参比用。以下操作按12.1.1~12.1.2进行。12.2.2测试液的配制
同12.1.3。
12.2.3副定
以空白脏器提取减液配制成pH14和pH10溶液为参比，测定检材及添加样品的吸收差值。求出各样品在260nm处pH14和pH10的吸收差值4E值。12.3计算
12.3.1添加药物回收率计算
回收率（%）=添加于空自中药物的4E、等量药物标准AE
12.3.2含量计算www.bzxz.net
检材AEX药物添加量（ug）)X检材落液体积（mL)X0.1W(mg/100g)=
添加标准品AEX检材重量（g）X添加样品落液体积（mL）13结果评价
13.1定性分析结果评价
13.1.1如果添加在空白中的药物回收率在60%以上时，检材未出现巴比妥类药物的特征吸收峰，即检材中不含巴比要类药物，阴性结果可靠。若回收率低于60%，阴性结果不可靠，应重新实验。13.1.2如检材pH14液在255mm有吸收，pH10液在240nm有吸收，说明可能有5.5取代巴比妥类药物存在，但不能证实是哪-种药物pH14液在305nm有吸收，pH2液在288nm有吸收，可能有硫喷妥存在。需进一步用气相色谱或薄层色谐分析，才能得出存在某一种药物的结论。13.1.3由于检材中药物含量少，或提取净化不好，紫外吸收不出现典型的巴比妥类药物吸收特征，不能否定该类药物的存在·必需进一步作薄层色谐或气相色谱分析，得出准确结论。13.2定量分析结果评价
第三高薄层色请法
14原理
检材中的巴比要类药物经提取，净化，浓缩、薄层色谐分离后，用硫酸汞，二羊卡巴腺液显色，其斑点的比移值（R）与添加提取的标准品比较，进行定性分析。15试剂
15.115.11同5.15.11#
15.12硅胶GFz薄层板（0.250.30mm）或高效硅胶GF牌层板。15.13显色剂
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15.13.1硫酸乘溶液：5g氧化乘落于200mL1：10硫酸中15.13.20.2%二苯卡巴晾路液：0.2g二萃卡巴粽用95%乙醇解到100mL.忙于棕色瓶中。15.14苯，丙酮，二乙胺，二氧六环氨水，环己烷16收器
16.1K·D浓缩器
16.2电动摄荡器
16.3台式旋祸振荡器
16.4微量注射器10pL.100mL
16.5展开缸
16.6喷雾器
16.7254mm波长紫外灯
操作方法
17.1提取和净化
同7.1。
17.2净化
17.3点样
距薄层板底部1.52.0cm处，间隔1.01.5cm处点5~10uL检材提取液，左右两边分别点5~10uL添加样品和单一药物标准使用液。17.4展开
在展开缸中放入下列展开剂中的一种，将点样后的幕层板放人缸中展开，当溶剂前沿展至7至10cm左右时取出，自然挥干溶剂，合适展开剂有：
羊.2醛=111
苯：丙酮=8:2
氧氯仿：无水乙醇=18：1
#仿：乙醚=311
氧仿，二乙胺=10：1
氧仿：二氧六环：二乙胺一8：41羊：二氧六环：氮-154#1
氧仿：环已烧，二乙胺-7211
苯，二氧六环，二乙胺=81211
上述展开剂R参考值见附录A中表A.17.5现察荧光
格展开并挥干落剂后的薄层板置254mm波长紫外灯下观案，用玻璃铅笔在薄层板背面记下各班点位置。
17.6显色
先用硫酸汞落减喷板显色，至各药物标准品出现白色班点为止，精等片刻后，维续喷二萃卡巴显色剂，至各斑点显蓝色，此时首质为蓝色，放置后背最追色，显出各药物的紫蓝色班点。如为高效硅腔胶尊层板，可用没流法显色。
结果评价
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18.1添加在空白脏器中的巴比要类药物经薄层展开，显色后，经估量的回收率在60%左右，检材中的阴性结果才可靠，如果器加样品未出现班点，阴性结果不可靠，应重新实验。或用气相色谱及气相色谱/质谱进行验证。
18.2用硫酸汞-二苯卡巴腺显色剂，油脂、蛋白质也出现蓝色，定性时要注意区分，并注意药物是否包含在油脂蛋白质之中。结合空白对照斑点予以判断。3用薄层色谱方法分析，必须选择二种以上展开剂，且斑点边缘清晰，方可确认。18.3
GA/T102-1995
附录A
巴比妥类药物色谱图及有关数据（参考件）
巴比要
崛内昇两巴比要
异皮巴比要
度巴比要
速可眠
疏喷妥
羊巴比要
巴比要类药物色谱图及数据
1一巴比要
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甲基衔生物RT《分）
2—烯丙异丙巴此妥
3一异皮巴比要
4一皮巴比要
5一速可眠
6—硫喷妥
7一羊巴此要
巴比要类混合药物衍生物色谱图及数据pHI
被长（nm）
巴比要卖5.5取代物在pH14
及PH10时的紧外吸收光谐
波长（nm）
硫喷要的藏外吸收光谱
巴比安类药物紫外吸收光谱图
展开剂
华Z是
羊：内刚（8：27
乳仿：无水乙醇（18·1）
乳仿：乙醛（3·1)
氯仿：二乙胺（10：1）
就仿！二凯大环·二乙肢
羊·二氯六环·氣
15+4-13
就仿·环己烷·二乙肢
(7-2-1)
萃·二氧六环：二乙岐
(8:2:1)
B1中毒症状
巴比要
GA/T1021995
巴比要类药物R参考值表
异皮巴
附录B
连可流 硫喷妥要 美多眠
安眠朋 导眠能茅英
巴比妥类安眠药中寿诊断都考资料（参考件）
特征是：昏迷，血压下降。休克，肌肉松弛，反射消失。具体表现在以下几方面。B1.1中枢神经系统方面
开始有眩晕，无力，语言不清，嗜睡，眼球展题、神智模糊，头痛，呕吐、恶心，发言不清、断新进入昏迷状态，并遥断加深，呼吸慢而浅并无规律，以后出现潮式呼吸。B1.2心血管系统方面
血管扩张，血压降低脉牌快而弱，维而缓慢。B1.3消化系统方面
肝功能异常，可产生黄胆肝炎.尿浑蚀，尿量减少，最后尿闭。B1.4神经系统方面
体温下降，皮肤湿冷，肌肉地缓，反时消失，皮肤上可出现疱疹或各种形式的皮肤到脱。巴比要药物中毒死亡机理
可以是延髓呼吸中枢麻痹，或由血管收缩中枢麻痹及微循环衰竭引起的休克，较多的是由于长时期昏迷合并支气管肺炎或肺水肿，也有因合并尿毒症而死。巴比妥类药物中毒死亡户体现象及病理解剖诊断B3
B3.1一般在2日内死亡的户件
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