【地方标准】 水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法

DB34/T3649—2020
水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法
Determination of residues of sulfonamides in aquatic Products ELISA method

【发布信息】
发布日期：2020-06-22
实施日期：2020-07-22
发布单位：安徽省市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省水产技术推广总站提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：安徽国泰众信检测技术有限公司、宁国市金东坊农业开发有限公司、宣城市金水源水产专业合作社、安徽省水产技术推广总站、合肥市畜牧水产技术推广中心、北京柏奥泰科技有限公司、合肥金荣生态农业有限公司。
本标准主要起草人：孙德祥、陈洪周、周作友、吴敏、王婷、何广、李瑞、红正、许世富、张武庆、姚杰、李先锋、桂涂、郭恒心、魏泽能、荣朝振、刘传涛、魏涛、钱之云、金家红、刘卫芳、王振、何超、范希芹、李珺、陈恩全。

1 范围
本标准规定了水产品中磺胺类药物残留量的测定酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定方法、检测限、准确度和精密度、结果确证。
本标准适用于水产品中磺胺甲噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯哒嗪残留量的测定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891 水产品抽样规范
农业部1077号公告-1-2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱串联质谱法
农业部1192号公告-1-2009 水产苗种违禁药物抽检技术规范

3 原理
试样中残留的磺胺类药物、酶标记抗原竞争结合磺胺类药物抗体，同时，磺胺类药物抗体又与微孔板上包被的磺胺类药物的二抗结合。加TMB底物后的颜色与试样中磺胺类药物的含量成反比，用酶标仪在450nm处测定吸光度值，以标准曲线算得对应试样中磺胺类药物浓度，乘以最终试液体积，除以最终试样质量，即得到残留量。

4 试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯；用水应符合GB/T 6682规定的二级水。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 乙酸乙酯：色谱纯。
4.3 正己烷：色谱纯。
4.4 乙醇水溶液：按84 mL乙腈：16 mL水混合。
4.5 氯化钠溶液。
4.6 磺胺类药物测定试剂盒：-2℃～8℃保存，组成参见附录A。
4.6.1 96孔酶标板：包被有抗磺胺类药物抗体的捕获抗体（二抗），8孔/条×12条。
4.6.2 系列标准工作溶液：0 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1.5 ng/mL, 5.0 ng/mL, 15 ng/mL, 50 ng/mL。
4.6.3 磺胺类药物抗体工作液。
4.6.4 HRP标记的磺胺类药物抗原工作液。
4.6.5 10倍样品提取液。
4.6.6 20倍浓缩洗涤液。
4.6.7 TMB底物。
4.6.8 终止液。
4.7 样品提取液：按10倍样品提取液（4.6.5）与水（V/V）=1:9进行稀释。-2℃～8℃保存，有效期1个月。
4.8 洗涤液：按20倍浓缩洗涤液（4.6.6）与水（V/V）=1:19进行稀释。-2℃～8℃保存，有效期1个月。

5 仪器和设备
5.1 酶标仪：配备450nm滤光片。
5.2 分析天平：感量0.01g。
5.3 组织捣碎机。
5.4 漩涡仪。
5.5 振荡器或超声波。
5.6 离心机：离心力≥4000g。
5.7 氮气吹干装置：温控范围室温-100℃。
5.8 恒温培养箱：温控范围0℃～60℃，温度均匀度±0.5℃。
5.9 可调移液器：单道20~200、100、1000、500-5000μL；八道50～300μL。

6 试样制备与保存
6.1 试样制备
水产品按GB/T 30891的规定执行；水产品种按农业部1192号公告-1-2009规定执行。采用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封做标识。
—取均质后的供试试样，作为供试试样。
—取均质后的空白样品，作为空白试样。
—取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
6.2 试样保存
于-18℃冰箱中避光保存，保存期6个月。

7 测定方法
7.1 测定条件
所有操作应在20℃～25℃室温下进行。试剂盒及所有试剂，使用前应提前60min以上取出，回升至室温后方可使用。
7.2 试样前处理
称取试样3g ± 0.02g于50mL离心管中，加入9mL乙醇水溶液（4.4），振荡或超声10min，离心力4000g离心10min；移取4mL上清液（相当于含1g原始试样）到另一50mL离心管中，加入2mL的氯化钠溶液（4.5）、8mL乙酸乙酯（4.2），漩涡振荡5min，离心力4000g离心5min；移取4mL乙酸乙酯层上清液（相当于含0.5g原始试样）到另一10mL离心管中，50℃-60℃氮气吹干：加1mL样品提取液（4.7），振荡或超声1min，加1mL正己烷（4.3）混合2min，离心力4000g离心5min，去除上层正己烷层：下清液用作试液。此最终试液体积（v）为1mL，所代表的最终试样质量（m）为0.5g。
7.3 酶联免疫测定
7.3.1 测定步骤
将所需的酶标板条插入板架（按每个标准工作液、试液、空白及质控溶液作两个平行计算），并记录对应位置。每孔加50μL标准工作液或试液、50μL HRP标记的磺胺类药物抗原、50μL 磺胺类药物抗体，用一次性吸头上下吸附振荡3次，轻轻振荡微孔板混匀1min，盖板膜，放入恒温培养箱中于22.5℃±2.5℃避光孵育60min。取出酶标板，孔向下甩出液体，加250μL洗涤液（4.8），轻轻振荡15s后甩出液体，重复操作3次，在吸水纸上拍打，完全除去孔中液体。加100μL TMB底物（4.6.7），轻轻振荡混匀，盖板膜，放入恒温培养箱中于22.5℃±2.5℃避光孵育15min。加100μL终止液（4.6.8），轻振荡混匀，稳定2min，用酶标仪于450nm波长处测量吸光度值（读数前，使用无绒布擦拭微孔底部水分和指纹）。注：不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有差别，应严格按说明书要求规范操作。
7.3.2 空白试验
除不加试样外，其余均按7.2、7.3.1进行。
7.3.3 结果计算和表示
用所获得的标准工作溶液和试液的吸光度值的比值进行计算，见式（1)：
相对吸光度值 (%) = (B / B0) × 100% --- (1)
式中：
A —— 相对吸光度值 (%)；
B —— 非0浓度标准工作液或试液的吸光度值；
B0 —— 浓度为0标准工作液的吸光度值。
以相对吸光度值 (%)为纵坐标，标准点浓度 (ng/mL) 为横坐标建立标准曲线。复得试样中磺胺类药物的残留量浓度，再乘以最终试液体积（v），除以最终试样质量（m），即可得出样品中磺胺类药物的残留量结果，按式（2）计算：
X = (c × v) / m --- (2)