【化工行业标准(HG)】 哺乳类动物细胞培养基

ICS 71. 080. 99
备案号：205172007
中华人民共和国化工行业标准
IIG/T 3935—2007
哺乳类动物细胞培养基
Cell culture media
2007-04-13发布
2007-10-01实施
华人民共和国国家发展利革秀员会发布
本标准附录A为资料性附录。
本标准由中国石油和化学工业协会提出。本标准由全国化学标准化技术委员会有机分会（SAC/TC63/SC2）归口。本标准由北京清大大一生物投术有限公司负责起草。本标准主要起草人：陈文庆、罗海春。HG/T3935-2007
哺乳类动物细胞培养基
HG/T 3935--2007
本标准规定了哺乳类动物细胞培养基的要求、试验方法、检验规则及标志、包装、运输、贮存。本标谁适用于嘴乳类动物细胞培养基。该产品主要用于哺乳类动物细胞培养。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标难达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版木适用丁本标准。GB/T191—2000包装储运图示标志（e9VISO780：1997）GB/T1250极限数值的表示方法和判定方法GH/T6679—2003固体化工产品采样通则中华人民共和国药典2005年版二部附录中华人民共和国药典2005年版三部附录中华人民共和国药典2005年版一部纯化水3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准，每升标示量marker liter
在产品包装上标注的配制11液体细胞培养基所需干粉细胞培养基的质量，单位为g。4分类和命名
哺乳类动物细胞培养基按主要成分的不同分为四型，其命名及对应士要成分见表1。HG/T 3935—2007
型号命名。
DMEM 粉未细胞培养基
199 粉术细胞培养基
MEM粉末细胞培养基
表 1哺乳类动物细胞培养基型号命名及对应主要成分主要成分
氯化钙、九水硝酸铁、氧化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、IL-精氨酸盐酸盐、I.胱氨酸盐酸盐、L-谷氮酰胺、甘织酸、I-组氨酸盘酸盐,L-尿充氨酸、L-充氨酸,L-懒氨酸盐酸盐、L-蛋纸酸,L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸,I-色氨酸,I. 酪氨酸,I.缬氨酸、L-郁萄糖，瀚红、内酮酸钠、D-泛酸钙、氧化胆碱、叶酸，I-肌醇、烟酰胺、盐酸吡够醛,核黄素、盐酸硫胺
氟化钙，九水硝酸铁、氧化、无水硫酸镁、磷酸二氢钾，氟化钠无水磷酸二氢钠.麟酸氨钠、T-丙氢酸、L-精氨蔽盐酸盐、L-天冬氨酸、I.-平胱氨酸盘酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氮酸、L-谷织酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-羟脑氨酸、L异亮氨酸、I.亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸,L-苯丙氨酸、I.脏氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氮酸、L-酪氮酸、L-氨酸、硫酸腺嘌呤、腺背酸、脱氧核糖、L-葡萄糖、谷胱甘肽(环原型)、盐酸鸟嘌呤、饮黄嘌呤、酚红、D-核精、乙酸钠、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄漂呤，维生素C、维生素E、维生末HI、I泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、L-肌死、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醚、盐酸吡哆醇,核黄素、盐酸硫胺、维生素 A醋酸酯氯化钙、九水硝酸铁、氨化钾、无水硫酸毯、氯化钠、光水磷酸二氢钠、工-精氮酸盐酸盘、L-天冬氨酸、I-天冬酰胺、L-胱氮酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、1-异亮氨酸、L-亮氮酸、L-懒氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、I-氨酸、D葡萄糖、红、丁酸、丁酸钠、D泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、L-儿醇、姻酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺四水硝酸钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化、磷酸氢二钠、L-精氨酸、L.天冬酰胺、I.天冬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、I.谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异RPMI1840粉末细胞培养基
亮氨酸、.亮氨酸、I-颗氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、I-鞘氨酸、L-丝氨酸，L-苏氨酸,L-色氮酸,L-酪氨酸,L-缬氨酸、T-葡萄糖,谷胱叶肽(还原型)、HEPES、鞘红、维叶:素 II、D-泛酸钙、氯化碱,叶酸、L-肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素,盘酸硫胺、维生素 Ble
每一型号可根据配方不同分为荠·“亚型。5性状
粉红色或类白色固体粉末。
6要求
乳类动物细胞培养基应符合表2所示的技术要求。澄清设
PII （每升标示量/L）
于燥减萤的质虽分效/%
渗透正b/(mOsm/kgH2 0)
细菌内毒素/(EU/mL)
微生物限度
细胞牛长试验
纠菌数/(CFTJ/g)
薛菌数/（CFT/g)
细驱形态
细咆牛长试验
表2技术要求
粉术细胞培养基
3. 2G--5. 6
338~291
每种亚型充许的H偏差范围为一心.30。每种亚易允许的渗透注偏差范围为工5%。试验方法
粉末纠胞培养基
HG/T 39352007
RPMI1640
木细施培养基
3. 90 -~6. 30
238-299
3. 90-G. 90
228--301
粉末纽胞培养基
6. 40~-8. 30
223~-273
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的诚剂和中华人民共利国药典2005年版中规定的纯水。
7.1澄清度的测定
称取每升标示量的实验室样品，置=1000mL烧杯中，加水1000mL，搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2005年版二部附录XB进行。7.2pH值的测定
称取每升标示量的实验室样品，置于1000ml.烧杯巾，圳水10001mL，搅拌垒溶解。按巾华人民共和国药典2005年版附录VH进行。7.3于燥减量的测定
接中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅢL1燥失重测定法送行，取两次平行测定结果的算术平为值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不火于这两个测定值的算术平均值的10%。
7.4渗透压的测定
称取每升标示量的实验室样品，置于1000mL烧杯中，加水1000mL，觉拌至溶解。按巾华人民共和国药典2005年版二部附录区G渗透法摩尔浓度测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5。
7.5细菌内毒素的测定
按中华人民共和国药典2005年版附录XE细菌内毒索检查法中的凝胶法进行。称取1/100每升标示量的实验室样品，精确至0.0001g，加入细菌内毒素检浩用水（市售）10mL溶解，吸取该溶液0.1mL加细菌内毒素检查用水（市售)3.9ml.,混勾即得试验溶液。7.6微生物限度的测定
按中华人民共和国药典2005年版附录X丁微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉茵数，3
HG/T3935—2007
检查法采用平血法。
称取实验空样品1，精确牟0.01名，加人无菌纯化水10mL溶解，混匀即得试验溶液。7.7细胞生长试验
7.7.1方法提要
7.7.1.1本试验所用容器具及游液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。7.7.1.2细胞在3.7℃恒温条件下，在含体私分数为10%小牛血清的细胞培养液中生长48h~72h，观察细胞形态并进行细跑计数；细胞生长48h-72h后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养48 h,观察细胞形态并进行细胞计数。7.7.2试剂和材料
7.7.2.1小牛血清：中华人民共和国药典2005年版三部附录XID，7.7.2.2平衡盐溶液：称取氯化钾0.2g，精确至0.01名无水磷酸二氢钾0.2g，精确至0.01g；氯化钠8.0g,精确至0.01号;无水磷酸氧二钠1.15盒·精确至0.001名：加纯化水1000mL，混勾、过滤除菌即得。
7.7.2.3VERO细胞：代次不超过150代。7.7.2.4细胞培养液：按产品使用说明书要求配制，7.7.2.5胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶（活力1：250)2.5g，精确至0.01.g加1000mL平衡盐溶液，混匀，过滤除菌即得。
7.7.3仪器
7.7.3.1医用净化工作台：洁净级别为级。7.7.3.2二氧化碳恒温培养箱：能通一.氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5士0.1）为，能在（37±1）℃恒温。
7.7.3.3细胞培养瓶：T25型、无菌。7.7.3.4显微镜：倒置、相差。
7.7.3.5血球计数板、
7.7.3.6盖玻片：无水乙醇浸泡并擦十。7.7.4试验步骤
7.7.4.1制备细胞悬液
7.7.4.1.1将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用平衡盐溶洗细胞·次。7.7.4.1.2向细胞培养瓶内加入腰蛋白酶溶液 1mL,于(37—1）C消化3min～5min。在显微镜下观察，当细胞变圆接近脱整时.将胰蛋口酶溶液倒掉。7.7.4.1.3根据细胞密度加入一定量细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱壁制成细胞悬液A。7.7.4.2细胞培养
7.7. 4. 2. 1吸取一定量的细胞悬液 A.到细胞培养瓶内。7.7.4.2.2向细胞培养瓶内加入10mL含体积分数为10%小牛血清的细胞培养液，使细胞接种密度为 5×104 细胞/ml.b
7.7.4.2.3将细胞培养瓶送人二氧化碳恒温培养箱，在（37士1）℃及.氧化碳体积分数为（5二0. 1）%条件下进行培养。
7.7.4.2.4培养48h~72h，观察细胞形态，并按7.7.4.3计数。7.7.4.2.5当细胞密度达到1×105细胞/mL时更换不含小牛血清的细胞培养液10ml.，继续培养48 h,观察细胞形态并计数。
7.7.4.3细胞计数
7.7.4.3.1将需要计数的细胞按7.7.4.1方法制备细胞悬液B。7.7.4.3.2吸取细胞悬液B100^L转移至离心管中，视细胞量确定是否稀释及稀释倍数。4
HG/T 3935—2007
7.7.4.3.3将盖玻片盖于计数板中心的计数室上方。调整计数板巾的细胞数量在100个~~300个。盖玻片边缘点加细胞悬液使其通过毛细作用自然渗入，不要留有气泡，不要外鲨，显微镜下计数。wwW.bzxz.Net
7.7.4.3.4观察计数板四角大方格中的细胞数，细跑压中线时，一般遵循“计左不计右，计上不计下”的原则，将计数板观察细跑数代人下列公式：计数板观察细胞数×10-×稀释倍数/4=细胞数/ml7.7.5分析结果的表述
培养18h~72h的细胞形态为成纤维样，贴壁生长，正常细胞形态参见附录A。72h内细胞数应达到1×105 细胞/mLs
继续培养48h的细胞形态为成纤维样，贴壁生长，正常细胞形态参见附录A，细胞计数应不小于1×10°细胞/mL
B检验规则
8.1表2技术要求中的所有项目均为出厂检验项目。8.2使用同一台混合设备-次混合量所生产的均质产品为一批。每批均必须检验。8.3按GB/T6679--2003的规定采样。将所来样品均勾分成两份，分别装于两个清洁干燥的无菌、密闭、避光容器内，粘贴标签，注明生产企业名称、产品名称、批号、生产日期，采样口期和采样者姓名。一份供检验用，另一份作为留样保存备查。8.4产品应出生产企业的质量检验部门进行检验。生产企业应保证出厂的产品均符合本标准要求，批出厂的产品都应附有一定格式的质量证明书，其内容包括：生产企业名称和地址，产品名称、批号、生产日期和本标谁编号等，
8.5检验结果的判定按GB/T1250修约值比较法逊行，检验结果如果有一项指标.不符合本标准要求时，应重新自两倍量的包装单元中采释进行复验，复验结果即使只有一项指标不符合本标准要求，则整批产品为不合格。
9标签、使用说明书
9.1标签
应有产品名称、亚型代号、批号、包装规格、生产日期、有效期至，生产企业名称、配制方法、本标准编号、每升标示量。
9.2使用说明书
应有产品名称、亚型代号、包装规格、有效期、生产企业名称、配制方法、使用方法、每升标示量10标患、包装、运输、贮存
10.1标志
包装容器上应有产品名称、亚型代号、批号、生产日期、有效期至、包装规格、数量、本标准编号等和GB/T191一2000规定的“向上”和“堆码层数极限标志等图形标志。10.2包装
10.2.1内包装
材料应符合国家药品包装材料标准，死析山物，不与哺乳类动物细胞培养基发生反应，可达到密封，避光效果并应采用辐照灭菌方法等。10.2.2外包装
具有避光效果，离地面一米自由落体，包装应不被损。5
HG/T3935—2007
10.3运输
采用封闭式运输上具。运输工具应消洁、卫生、于燥，不得与有毒或不清物混合装运。运输途中需防止口晒、丽淋、受潮和污染，10.4存
产品需在2℃～8℃库房贮存。仓库环境应清洁。产品可按照包装标志堆放，但应定期维护，如翻垛、外观检查、抽检等。在以贮存条件下，自生产日期起产品有效期为一年。乳动陷培养
附录A
(资料性附录）
VERO 细胞正常细胞形态图
A.1VERO细胞正常细胞形态图见图A.1。美国菌种保藏中心(ATCC)号：CCL-81形态特征：成纤维样,贴壁生长
资源网址：atcc.org
High Dinsity
Scaleliarel0Qμm
VERO细胞正常细胞形态图
IIG/T 3935—2007
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。