【地方标准】 鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程

ICS65.150 CCSB52 江 DB32 苏省地方标准 DB32/T4727—2024 鳅鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程 Technical code of practicefor the diagnosis,prevention,andcontrol ofinfectious spleen and kidney necrosisin mandarinfish地方标准信息服务平台 2024-04-03发布 江苏省市场监督管理局 中国标准出版社 发布 版 出 2024-05-03实施 前言 DB32/T4727—2024 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省农业农村厅提出本文件由江苏省渔业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：扬州大学。 本文件主要起草人：张晓君、高晓建、姜群、刘晓丹、朱鑫海、姜姿妍、周一凡。地方标准信息服务平台 1范围 鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程 本文件规定了鱼传染性脾肾坏死病的诊断、综合防控和记录。DB32/T4727—2024 本文件适用于鱼传染性脾肾坏死病毒的检测以及簸鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控。2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB11607渔业水质标准 水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7103 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义4诊断 4.1 现场调查 水质情况包括水、水色、水温、透明度、PH、亚硝酸盐、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密度、苗种来源、饵料鱼来锅等。4.2 临床诊断 患病鱼表现为沿池边漫游而死，鳃盖、口吧周围下颌、胸鳍、腹鳍充血，鳃发白，解剖后肝脏呈现白色息服务平台 或有出血点，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点，部胆囊肿大，部分幽门盲囊出血（见附录A图A.1)。4.3 检测方法 4.3.1 试剂材料 试剂材料： a) b) 无水乙醇（分析纯）； 三氯甲烷（分析纯）； 异戊醇(分析纯)； e） d) e) f) 1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH8.0；1%十二烷基硫酸钠（SDS)； ddH.o; 1 DB32/T4727—2024 g) h) 1) j) k) 1) m) n) o) p) q r) s) 4.3.2 10mmol/LTris-HCl.pH8.0,4C保存；Tris饱和酚，4℃保存； 8U/μLBstDNA聚合酶，一20℃保存；10mmol/LdNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L），-20℃保存：10000XSYBRGreenI，-20℃保存；25mmol/LMgClz，-20℃保存； 10XLAMP缓冲液，一20℃保存； 5mol/L甜菜碱，一20℃保存； 10XPCR缓冲液，一20℃保存； 5U/μLTaqDNA聚合酶，-20℃保存；20mg/mL蛋白酶K，一20℃保存；LAMP检测引物序列： F3:5'-AACCACCAGGCAGAAATGG-3 B3:5'-ATCCGAGGCGACGTCATC-3* FIP:5-TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT-3BIP:5'-AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG-3巢氏PCR检测引物序列： MCP-F1:5'-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3MCP-R1:5'-TTACAGGATAGGGAAGCCTG-3MCP-F2:5'-GCGTTTGATGCGATGGAGAC-3\MCP-R2:5'-ACGGCAGAGACACGGTAGGC-3仪器设备 仪器设备包括： a) b) e d) e f) g) h) 4.3.3 灭菌锅； 水浴锅； PCR仪； 紫外分光光度计 电泳仪； 电泳槽； 凝胶成像系统； 离心机。 采样 脏、脾脏、肝脏，匀浆后用于DNA提取、4.3.4检测样本模板制备 务平 利用酚-氯仿（三氯甲烷）法抽提混合组织DNA。每个样品取组织100mg~200mg，匀浆后置于1.5mL微量离心管，加人含蛋白酶K的裂解液（10mmol/LTris-HCl.pH8.0：1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS）.60℃消化1h~3h 用Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混合液提取、纯化DNA，一20℃冷冻的无水乙醇沉淀2 DB32/T4727—2024 DNA，自然干燥，溶于灭菌ddH,O。紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。DNA样品置于一20℃冰箱保存备用。环介导等温扩增（LAMP检测方法4.3.5 4.3.5.1 LAMP扩增 按表1加入各项试剂进行LAMP扩增，同时以ddHO为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，LAMP的反应条件：65℃保持60min，80℃终止反应10min。表1 试剂 DNA模板 内引物（FIP、BIP） 外引物（F3、B3） dNTPs(10mmol/L） 10XLAMP缓冲液 甜菜碱（5mol/L） MgCl(25mmol/L) BstDNA聚合酶（8U/μL） ddH.o LAMP检测结果判断 4.3.5.2 LAMP反应体系（25uL） 体积 证 2 各1 各1 2.5 2.5 4 2 1 补足至25 将1uL10000XSYBRGreenI荧光染料加人LAMP反应产物，振荡后观察混合液颜色，绿色为阳性，橙色为阴性（见图A.2）。 4.3.6 4.3.6.1 巢式PCR检测方法 PCR扩增 按表2加人试剂进行第一轮PCR扩增同时以ddH,O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，PCR的反应条件：94℃预变性5min、94℃变性3058℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次后72℃延伸10min。 表2第一轮扩增反应体系（251）务 试剂 DNA模板 MCP-F1 MCP-R1 10XPCR缓冲液 0.5 0.5 2.5 3