【地方标准】 禽霍乱防制技术规程

ICS11.220 B41 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T27—2020 代替DB15/T27-1992 禽霍乱防制技术规程 Prevention Technical SpecificationsforAviancholera地方标准信息服务平台 2020-07-30发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-08-30实施 发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。DB15/T27—2020 本标准代替了DB15/T27-1992《禽霍乱防制技术规程》，与DB15/T27-1992相比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 修改了诊断技术、防制措施和考核验收标准（见3、4、5，1992版的2、3、4）。本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：申捷、马立峰、张伶利、萨茹拉、郭宇、贾皓、云涛、戴晓光、苏胜杰、王永杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。本标准的历次版本发布情况为：—DB15/T27—1992。 地方标准信息服务平台 1范围 禽霍乱防制技术规程 本标准规定了禽霍乱的诊断技术、预防和控制措施。本标准适用于饲养、经营、运输、屠宰、加工禽只的单位和个人。2规范性引用文件 DB15/T27--2020 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范3诊断技术 3.1流行特点 本病是由多杀性巴氏杆菌引起的鸡、火鸡、鸭、鹅等多种禽类的传染病，鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽以及其他鸟类均易感，所有日龄禽类均可感染发病，但性成熟的成年鸡群更易感。本病一年四季均可发生。本病呈世界性分布，急性暴发时，发病率和死亡率均很高。3.2 临诊诊断 3.2.1急性型症状 急性感染的禽中食只突然死亡，随后即出现感染禽只发热、厌食、沉郁、腹泻、羽毛粗乱、病粗糖约半关，长药1-3 准 呼吸困难，临死前鸡冠、肉垂熏紫色，鹅发病后肉肿胀，有热痛感，直至衰竭，昏迷而死。本3.2.2慢性型症状 信 急性型耐过或由弱毒菌株感染的禽只可呈慢性型病程，其特征主要表现为精神沉郁，食欲下降，伴有不同程度腹泻，冠髯水肿，关节肿胀发炎可致跋行，1分泌物增多。3.3病理变化 急性型的病变主要是全身出血，肝脏肿大，呈棕色或棕黄色，表面害布针小大灰白色坏死点，脾脏和肺脏均肿大，肺脏上可见出血点，心包增厚，心包液增多，肌胃出血，肠容物含血液，有出血性肠胃炎。慢性型主要是局部感染，在关节、趾垫、腱鞘、眼结膜、肉垂、气囊、中耳、骨髓、脑膜等部位呈现纤维素性化脓性渗出、坏死或不同程度的纤维化3.4实验室诊断 1 DB15/T27—2020 3.4.1血清学诊断 3.4.1.1琼脂扩散试验（该方法不适用于水禽）3.4.1.1.1配制琼脂板 取pH6.4的0.01mo1/LPBS溶液100mL，放于三角瓶中，加入0.8g~1.0g琼脂糖，8g氯化钠，将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖熔化，再加入1%硫柳汞1mL，冷却至45℃～50℃时，将洁净干燥的直径90mm的无菌平皿置于平面上，每个平Ⅲ加入18mL～20mL琼脂糖溶液，加盖待凝固后，将平Ⅲ倒置以防水分蒸发。放入普通冰箱中保存备用（时间不超过2周）。若购买成品琼脂板试剂盒，可按照说明书要求进行配制。 3.4.1.1.2打孔和封底 可用直径4mm的打孔器在已凝固的琼脂板上打孔，然后小心将孔中的琼脂挑出，用酒精灯轻烤平血底部封闭孔的底部，以防侧漏。3.4.1.1.3加样 将稀释的抗原（按照试剂配制要求进行稀释）悬液滴入到中间孔，标准阳性血清加入外周的1、4孔中，标准阴性血清和待检血清按顺序分别加入外周2、3、5、6孔中。每孔均以加满不溢出为度。3.4.1.1.4感作 加样完毕后，静置5min-10min后倒置放入湿盒内，37℃中静置，分别在24h和48h观察结果。3.4.1.1.5结果判定 3.4.1.1.5.1将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出沉淀线，则试验成立。3.4.1.1.5.2若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性：若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线一端在被检血清孔外向抗原孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验，如仍为弱阳性，则判为阳性：右技检血与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线指向被检血清孔，则被检盘请判头阴：若被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉直伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若仍出现非特异性反应则判为阴性。判阳性者视为禽体内存在禽霍乱抗体。哈息 3.4.2病原学诊断 3.4.2.1涂片、镜检 用镊子夹持病变组织肝或脾，然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层：若取血液，用灭菌剪刀剪开心脏进行蘸取或剪取凝血块、用新鲜切面在载玻上压印或涂抹成薄层；若是已经培养纯化的细菌，从菌落挑取少量涂片。将制备好的涂片火焰固定后进行革兰氏和瑞氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，菌体大小为（0.2Hm～0.4Hm）×（0.6m～2.5Hm），单个或成对存在，瑞氏染色呈两极着染。3.4.2.2分离培养和鉴定 2 DB15/T27—2020 按照NY/T541的要求采集并保存样品；最急性和急性病例，可采集濒死或死亡禽只的肝脏、脾脏、心脏和血液等：慢性病例，一般采集局部病灶组织：活禽，通过鼻孔挤出黏液或将棉拭子插入鼻腔中采样。对不新鲜或已被污染的样品，可采集骨髓样。将病料接种于5%鸡血清的葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基或5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基，在35℃～37℃下培养，经18h～24h后，菌落直径为1mm~3mm，呈散在的圆形凸起，露滴样或水滴样。3.4.2.3动物试验 细菌纯培养物计数稀释后，以1000CFU细菌经皮下或腹腔内接种小鼠、兔或易感鸡，接种动物在24h～48h内死亡，并可从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。3.4.2.4多杀性巴氏杆菌PCR检测方法3.4.2.4.1器材 生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭菌锅、研钵。3.4.2.4.2试剂 Taq酶、DNA模板、dNTPs水、无菌双蒸水、DL2000DNAMarker、TAE、琼脂糖、。3.4.2.4.3DNA模板的制备 3.4.2.4.3.1组织样品制备 组织样品的处理：取约0.5g的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加2mL灭菌生理盐水混匀。反复冻融3次，3000r/min离心5min，取上清液转入无菌的1.5mL塑料离心管中并编号，样本在2℃～8℃条件下保存，应不超过24h。若需长期保存，应放在-70℃以下冰箱，但应避免反复冻融。 纯化培养的细菌样品处理：对分离鉴定和纯化培养的细菌液体培养样品，直接保存于无菌的1.5ml塑料离心管中密封，编号、保存和送检。热裂解法 3.4.2.4.3.2 采用热裂解法提取DNA，用枪头北取菌液或菌株培养物加入到含100μ无菌双蒸水的离心管中，反复吹打，沸水浴10min后立即放入20C水管冷冻5min，然后放入高速离心机12000r/min离心1min唯信息 上清液即为PCR扩增用DNA模板。3.4.2.4.3.3试剂盒法 做为模板，DNA模板可置于-20℃保存备用。3.4.2.4.4PCR反应体系 PCR反应体系见表1。 3