【地方标准】 饲料中呕吐毒素的测定高效液相色谱法

DB51/T1079—2010 饲料中呕吐毒素的测定 高效液相色谱法
发布单位：四川省质量技术监督局
发布与实施日期：2010年6月1日发布，2010年7月1日实施

前言
本标准由四川省畜牧食品局提出并归口，四川省质量技术监督局批准，由四川省饲料工作总站负责起草。主要起草人包括柏凡、张静、李云、冯娅、魏敏、赵立军。

1 范围
本标准规定了测定饲料中呕吐毒素含量的高效液相色谱法(HPLC)，适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料。检出限为0.3 mg/kg。

2 规范性引用文件
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14699.1 饲料采样
GB/T20195 动物饲料试样的制备

3 原理
试样经纯水提取、离心、过滤后，取滤液通过免疫亲和柱净化、浓缩，用高效液相色谱仪配紫外检测器检测，通过外标法计算呕吐毒素含量。

4 试剂和溶液
除特殊说明外，所有试剂为分析纯，色谱用水符合GB/T6682一级用水要求。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 甲醇：色谱纯。
4.3 聚乙二醇8000（PEG8000）。
4.4 吐毒素标准品：含量>98%。
4.4.1 标准贮备液：精密称取10 mg呕吐毒素标准品，用乙腈溶解定容至100 mL，浓度为100 μg/mL，置于2~8℃保存，有效期6个月。
4.4.2 标准工作溶液：从贮备液配制0.3、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL工作溶液，置于2~8℃保存，有效期1个月。
注意事项：接触呕吐毒素的容器需浸入4%次氯酸钠溶液清洗，操作人员需佩戴医用乳胶手套，在通风橱内操作。

5 仪器与设备
5.1 分析天平：感量0.1 mg
5.2 振荡器
5.3 离心机：转速≥5000 r/min
5.4 超纯水处理器
5.5 涡旋混合器
5.6 高效液相色谱仪：配紫外检测器及氮吹仪
5.7 0.45 μm滤膜

6 试样制备
按GB/T14699.1采集试样，按GB/T20195选取代表性实验室样品1 kg，四分法缩减至约200 g，粉碎过1 mm孔筛，混匀装入磨口瓶备用。

7 分析步骤
7.1 试样溶液制备
7.1.1 提取：称取25 g试样于锥形瓶中，加入5 g PEG8000、100 mL水，振荡30 min，离心，取上清液过滤。高浓度滤液可稀释以防免疫柱超载。
7.1.2 净化：免疫亲和柱排出缓冲液，用1 mL水过柱，吸取2 mL提取液以1滴/秒通过免疫柱，用5 mL水淋洗，抽干柱子，用2 mL甲醇洗脱，60℃氮吹干，加入500 μL流动相，涡旋30 s，过0.45 μm滤膜，上机测定。
7.2 色谱条件
7.2.1 色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，粒度5 μm，或等效柱
7.2.2 柱温：30℃
7.2.3 流动相：乙腈:水=12:88(体积比)
7.2.4 流速：1.0 mL/min
7.2.5 检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长220 nm
7.2.6 进样量：40 μL
7.3 测定：将标准溶液和试样溶液分别上机，按保留时间定性，采用单点或多点外标法定量。

8 结果计算
试样中呕吐毒素含量X，以mg/kg表示，单点校正公式：X = (A_x × C_s × V) / (A_s × m) 其中，V为上机定容体积(mL)，A_s为标准溶液色谱峰面积，A_x为试样色谱峰面积，m为试样质量。