【地方标准】 饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法

DB32/T4367—2022
饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定时间分辨荧光免疫层析定量法

1 范围
本文件规定了饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品制备、样品前处理、标准曲线制定、检测过程、结果计算和方法性能。本文件适用于饲料原料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料等试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14699.1 饲料采样
GB/T20195 动物饲料试样的制备

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 时间分辨荧光微球 (Time-resolved fluorescent microsphere)：形状为球形，直径在纳米至十微米之间，微球表面或内部负载有荧光物质，在受到一定的能量激发时能够发出荧光的微粒，比普通荧光半衰期长。微球表面修饰有合适密度的羧基或其他功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联；微球所含的稀土元素经过了整合，无需解离增强步骤。
3.2 时间分辨荧光免疫层析定量法 (Time-resolved fluorescence immunochromatography quantitative method)

4 原理
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与时间分辨荧光微球标记的特异性抗体结合后，抑制了层析过程中标记抗体与试纸条T线脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原的免疫反应，使T线时间分辨荧光强度降低；质控线C线结合的荧光标记物浓度与样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度无关。层析结束后，通过仪器检测计算试纸条T线和C线的时间分辨荧光强度比值，并与设定的标准曲线进行准确定量分析。

5 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
5.1 十二水磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)
5.2 磷酸二氢钾 (KH2PO4)
5.3 氯化钾 (KCl)
5.4 氯化钠 (NaCl)
5.5 盐酸 (HCl)
5.6 甲醇 (CH3OH)
5.7 蔗糖 (C12H22O11)
5.8 牛血清白蛋白 (BSA)：纯度≥98%
5.9 吐温-20 (Tween-20)
5.10 磷酸盐缓冲溶液：取2.178g磷酸氢二钠（5.1）、0.144g磷酸二氢钾（5.2）、0.12g氯化钾（5.3）、4.8g氯化钠（5.4)，溶解于1L水中，用适量盐酸（5.5）调pH至6.8～7.2。
提取液：取800mL甲醇（5.6）用纯水定容至1L，用于样品提取。
5.11 稀释液：在1L磷酸盐缓冲溶液（5.10）中分别加入2.5g蔗糖（5.7）、1.0g牛血清白蛋白（5.8）和2.0g吐温-20（5.9）混匀，用于样品上清的稀释。
5.13 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液：浓度200mg/L。
5.14 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备液：取脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液（5.13）1mL于2mL容量瓶中，用甲醇（5.6）定容，混合均匀，制备成浓度为100mg/L的储备液。
5.15 ID卡：用于存储标准曲线和项目信息，直接插入荧光免疫定量分析仪使用。
5.16 脱氧雪腐镰刀菌烯醇时间分辨荧光免疫层析定量试纸条（图1）：灵敏度不低于100μg/kg。试纸条结构包含：样品垫、加样孔、结合垫、NC膜、T线、C线、吸水垫、底板。
注：结合垫包被荧光微球标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，T线包被脱氧雪腐镰刀菌烯醇封闭抗原，C线包被二抗。