【地方标准】 蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术规程

ICS65.020 CCSB16 DB13 河東北貢 國方标准 省地 DB13/T5688—2023 蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术规程地方标准信息服务平台 2023-05-06发布 河北省市场监督管理局 发布 2023-06-06实施 DB13/T5688—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：石家庄赞皇县蕊源蜂业有限公司、中国农业科学院蜜蜂研究所、石家庄市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：王强、王荣申、王岳森、魏月、王岳峰、孟君丽、许亚改、王占江、陈海军、郭伟婷、张艳红、杜义明、刘旭东、孙继强、姚慧敏、谢峰、马丽荣、路伟、张晨、贾二国、王聪敏。 地方标准信息服务平台 1范围 蜜蜂微抱子虫病绿色防治技术规程DB13/T5688—2023 本文件规定了蜜蜂微孢子虫病绿色防治的术语和定义、技术流程图、诊断与鉴定、防控等技术要求。 本文件适用于蜜蜂微孢子虫病症状、形态及分子生物学诊断和综合防治。2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19168蜜蜂病虫害综合防治规范SN/T1683蜜蜂微孢子虫病诊断方法OIE陆生动物卫生法典 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 蜜蜂微孢子虫 是一种侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞引起蜜蜂发病的致病性真菌，包括蜜蜂微孢子虫和东方蜜蜂微孢子虫2个种。 3.2 消毒 指为杀灭包括蜜蜂疫病病原体或寄生虫而采取的一种措施，适用于可能被直接或间接污染的场信总履务平台 所、工具及各种物体。 [来源：OIE陆生动物卫生法典，有修改]。3.3 监测 地方 指系统而持续地收集、整理和析与蜜蜂微孢子虫病有关的信息，并及时向相关人士传递信息以便采取相应的措施。 蜜蜂微孢抱子虫病绿色防治技术密蜂微抱子虫病绿色防治技术流程图（如图1）：3 DB13/T56882023 开始 5诊断与鉴定 6防控 给束 5.1诊断流程 5.2症状 5.3实验空鉴定 5.1取详 6.1养蜂场场址选 6.2饲养管理 6.3监测 6.4防治 5.2.1蜂群症状 5.2.2富娃个味症决 5.3.1星微镜鉴定 5.3.2PCR鉴定 5.4.1取样数量 5.4.2取样方法 5.4.2 样品保存 6.2.1饲料 6.2.2预防消毒 6.4.1预防 6.4.2治疗 图1 蜜蜂微孢子虫病绿色防治技术流程图地方标 5诊断与鉴定 5.1诊断流程 6.2.1.1春饲料 6.2.1.1越冬料 当观察到蜂群出现典型症状时，应遵循先通过个体症状观察初步确诊，再取样后通过显微镜鉴定即可确诊。如需对没有明显症状的蜂群进行早期诊断或例行养蜂场的病害监控则可采用PCR鉴定方息服务平 法。 5.2症状 5.2.1蜂群症状 5.2.1.1急性重症感染 当蜂群感染处于后期重症阶段时有如下症状：蜂群粪便：蜂箱外壁或周围地面会出现大量棕色约0.5cm长的细长条状粪便，或出现粪便a 变稀、颜色变深现象： b) 蜂群表现：在蜂巢入口处及养蜂场地面，会见到患病爬行的和死去的蜜蜂，且蜂群群势急速下降。 5.2.1.2轻度感染 除了部分成年蜜蜂在蜂箱外爬行外，没有其他异常表现。5.2.2蜜蜂个体症状 蜜蜂个体感染病原后可通过如下症状进行初步判断。DB13/T5688—2023 a）病蜂活动状况，患病蜜蜂表现出行动迟滞，腹部膨大，飞翔无力等症状用镊子从具有典型症状的蜜蜂腹部末端夹出中肠及后肠仔细观察，健康蜜蜂中肠呈棕色，b) 环纹明显，并且具有弹性和光泽。如观察到蜜蜂中肠膨大，呈乳白色，环纹不清，失去弹性和光泽，可初步确定为蜜蜂微孢子虫病。5.3实验室鉴定 5.3.1显微镜鉴定 5.3.1.1样品处理 将采集的蜜蜂样本，分离腹部置于研钵中，加入5mL～10mL蒸馏水研磨。取研磨的组织涂片，在明场或相差光学显微镜下以400～600倍进行检查。5.3.1.2鉴定 5.3.1.2.1初诊 如在视野中见到长约5um～7um，宽约3um～4um，椭圆形的孢子，边界折光明显，则可初步确诊。 5.3.1.2.2鉴别 按SN/T1683相关方法与酵母、真菌孢子、脂肪体或马氏管变形虫囊包进行鉴别。5.3.2PCR鉴定 5.3.2.1DNA提取 提取缓冲液配方见表1： 表1DNA提取缓冲液配方 试剂名称 CTM EMTA Nacr 示准信 注：缓冲液最终用ddH20将pH值调至8.0操作步骤如下： 浓度 0.03M 0.05M 0.01M 1.1M 置于一个预前（加入液氮）1.5mL离心管中并匀浆：取蜜蜂的中肠（取样部位见图1），a) b) ) d) e) f) g) h) i) 离心管中加入300uL提取缓冲液以及4L20g/mL的蛋自酶K溶液，置于60℃水浴3h加入等体积（300μL）的苯酚：氯仿为1：1的混合液轻轻温匀，13000rpm离心15min将上清液移至另一个新管中，沉淀物重复用苯酚：氯仿为1，，的混合液混匀并离心1次，合并2次的上清液； 加入预冷的600μL95%的乙醇后加入30μL3mol/的Na0Ac，轻轻混习，置于-20℃下过夜： 10000rpm离心15min，移去上清液，沉淀用1mL70%的乙醇洗涤两次烘干10min后加入30uLddH20，置于65℃水浴10min，轻轻溶解混匀管中的沉淀物10000rpm离心10s以除去未溶解的物质，即得蜜蜂中肠组织的DNA；提取的DNA溶液置于-20℃保存，备用。5