【地方标准】 梨火疫病监测与检测技术技术规程

ICS 65.020.01
CCS B 16

DB 32
江苏省地方标准
DB32/T 4394—2022

梨火疫病监测与检测技术规程
Code of practice for monitoring and detection of pear fireblight

2022-11-14 发布
2022-12-14 实施
江苏省市场监督管理局 发布
中国标准出版社 出版

前言

本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省园艺标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省农业科学院、江苏省植物保护植物检疫站。本文件主要起草人：刘凤权、赵延存、徐高歌、李朝辉、龚伟荣、孙伟波、赵杨扬、明亮、周丽川、胡婕。

1 范围

本文件规定了梨火疫病监测与检测的原理、监测植物、设备与试剂、病害监测、病菌检测、结果判定和报告、样品和菌株保存及无害化处理等。本文件适用于梨火疫病监测与病菌检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 15569 农业植物调运检疫规程
GB/T 36852 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法
DB32/T 3788 梨枯梢病监测与检测技术规程

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 原理

梨火疫病，病原为梨火疫病菌 [Erwinia amylovora (Burrill, 1883) Winslow et al., 1920]，是危害梨、苹果、杜梨、山茱萸、海棠、花楸等蔷薇科植物的检疫性有害生物。根据梨火疫病田间症状、病原生物学特征、致病特性、免疫学和分子生物学反应特征等进行监测和检测。

5 监测植物

梨和苹果。

6 设备与试剂

6.1 用具与仪器
采集夹、采集袋、标本夹、标本纸、修枝剪、纸袋、放大镜、镊子、刀片、标签纸、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、体视显微镜、低温高速离心机、电泳仪、聚合酶链式反应（PCR）仪、凝胶成像系统、微量移液器、定位器等。

6.2 试剂与材料
监测与检测过程中所有试剂、溶液及培养基配方，参见附录 A。除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。

7 病害监测

7.1 监测范围
监测梨、苹果集中种植区。对疫情发生区或高风险区的果园、苗圃和采穗圃，以及从发生区或高风险区调入的苗木、砧木、接穗和花粉等进行重点监测。

7.2 田间监测

7.2.1 监测时期
每年 4 月～7 月，重点在梨树、苹果树开花期到果实膨大中期进行监测调查，尤其是在雨后或浇水后。

7.2.2 访问调查
向当地植保员、农技员、果农、种苗和农药经销商等相关人员询问梨树和苹果树果园、苗圃和采穗圃是否有梨火疫病疑似症状（见附录 B）及其发生地点、时间、危害情况等信息，判断是否存在可疑发生区。每年在花期和幼果期各调查 1 次。

7.2.3 踏查
对访问调查发现的可疑发生区和其他有代表性的果园、苗圃和采穗圃进行踏查，观察田间是否有梨火疫病典型症状（见附录 B）。如发现典型或可疑症状的病株，立刻进行标记和拍照，取样后送实验室检测鉴定。每年在花期和幼果期各踏查 1 次。

7.2.4 定点监测
在踏查确认的疫区或高风险区，选择有代表性的果园、苗圃和采穗圃进行定点调查，每 15 d 调查 1 次。面积小于 50 亩的设置 1 个调查样地，面积每增加 50 亩增设 1 个调查样地，样地面积不小于 5 亩。在样地内采用 5 点取样法，每个点调查不少于 20 株，调查并统计病株率。按照附录 C 要求记录相关监测信息。

7.3 调运监测

7.3.1 苗木、砧木、接穗监测
对来自疫情发生区或高风险地区的种苗、砧木、接穗按 GB 15569 要求进行抽样检查，对病样或疑似病样送实验室进行检测鉴定；对无症状样品，至少随机选取 5 份送实验室检测鉴定。

7.3.2 花粉监测
按 GB 15569 要求进行抽样，并送实验室检测鉴定。

8 病菌检测

8.1 样品处理

8.1.1 病样和疑似病样处理
按照 GB/T 36852 要求执行。

8.1.2 无症状样品处理
先用 75% 乙醇对样品表面进行消毒，晾干，然后从每个无症状种苗、接穗、砧木随机切取新生树皮（包含维管束部分）2 块～3 块，每块约 20 mm，加入到装有 2 mL～3 mL 无菌水的无菌离心管中浸泡 30 min，制备样品浸出液。每份花粉样品取 0.1 g，加入到装有 1 mL～2 mL 无菌水的无菌离心管中浸泡 30 min，制备样品浸出液。

8.2 显微镜检查
按照 DB32/T 3788 要求执行。

8.3 生物学特征观察
将样品浸出液在 NA 培养基平板上划线或梯度稀释分离，28 ℃培养 24 h～48 h。挑取单菌落在 NA 培养基上进一步划线纯化 2 次～3 次，观察并记录菌落形态和其他特征，也可用透射电镜观察菌体形态、大小、有无鞭毛及鞭毛着生的位置和数目等（参见附录 B）。

8.4 致病性测定
将纯化的分离物接种幼果，24 h～48 h 后观察接种部位有无坏死和菌脓产生；或接种嫩梢 48 h～96 h 后，观察接种点是否出现变黑、组织干枯、枝梢萎蔫、菌脓溢出等症状。

8.5 ELISA 检测
取样品浸出液或用纯化的分离物制成的菌悬液进行酶联免疫吸附测定（ELISA）检测，检测程序参见附录 D。如采用商品化 ELISA 试剂盒检测，按照说明书操作并进行结果判定。

8.6 PCR 检测
根据实验室条件，可选择 PCR 凝胶电泳检测或实时荧光 PCR 检测，检测程序按照附录 E 执行。

9 结果判定和报告

9.1 结果判定

9.1.1 田间症状初判
田间梨树和苹果树发病症状符合附录 B 描述的典型症状，初步判断为梨火疫病并送实验室检测鉴定。