【地方标准】 布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法 荧光免疫层析法

DB34/T4044—2021
布鲁氏杆菌病抗体快速检测方法 荧光免疫层析法
(The Rapid detection methods for antibodies to brucella: The hypersensitive fluorescence immunochromatographic assay)

安徽省地方标准
发布日期：2021-09-30
实施日期：2021-10-30
发布机构：安徽省市场监督管理局

前言
DB34/T4044—2021
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由阜阳市动物疫病预防与控制中心提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。
本文件起草单位：阜阳市动物疫病预防与控制中心、安徽省荷森生物技术有限公司、成都微瑞生物科技有限公司、阜南县动物疫病预防与控制中心、颖上县动物疫病预防与控制中心、颖东区枣庄镇农业综合服务站、庐江县动物疫病预防与控制中心、安徽省质量认证服务中心。
本文件主要起草人：高树朋、皆振义、刘雪梅、蔡强、李超、吴雪荷、张明飞、周铜铜、张贺森、高永士、杨琳、李晓辉、陈菁菁。

1 范围
本文件规定了布鲁氏杆菌病抗体快速检测——荧光免疫层析法的原理、仪器和试剂、样品采集与处理、操作方法、结果分析、生物安全及防污染措施。本文件适用于猪、牛、羊的布鲁氏杆菌病抗体水平的快速检测。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范
NY/T 541 动物检疫——兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 原理
荧光免疫层析法（The Hypersensitive Fluorescence Immunochromatographic Assay, HFIA）快速检测布鲁氏杆菌病抗体，是采用铕（Eu3+）元素荧光纳米微球作荧光示踪物，分别标记布鲁氏杆菌LPS抗原和鸡IgY，并埋置在标记垫内。硝酸纤维素膜上检测线（T）包被布鲁氏杆菌特异性单抗，参考线（C）包被兔抗鸡IgY的IgG。血清样品抗原与埋置在标记垫内标记的布鲁氏杆菌LPS抗原荧光纳米微球反应形成复合物，从而抑制与包被在硝酸纤维素上检测线（T）布鲁氏杆菌单抗反应，使检测线（T）荧光信号较弱。其余物质继续向前层析，在C线处与包被荧光标记鸡IgY的抗鸡IgY结合形成免疫结合物。用高敏荧光分析仪读取检测卡上的荧光信号，根据标准曲线计算得出布鲁氏杆菌病抗体效价。

5 仪器与试剂
5.1 仪器
5.1.1 高敏荧光分析仪：激发波长为 (400±20) nm，检测波长为 (615±10) nm。
5.1.2 单道可调移液器：10~100 μL，100~1000 μL。
5.1.3 离心机：转速 3000~15000 r/min。
5.1.4 冰箱：2℃~8℃，-20℃。

5.2 试剂
5.2.1 实验用水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
5.2.2 样品稀释液
5.2.2.1 成分：十二水磷酸氢二钠 2.68 g，二水磷酸二氢钠 0.44 g，叠氮化钠 1 g，硫酸葡聚糖 (MW: 40000) 5 g，硫酸葡聚糖 (MW: 20000) 10 g，双蒸水 1000 mL。
5.2.2.2 制法：将上述成分溶解混匀后分装，保存于 4℃ 备用。
5.2.2.3 所有试剂均为分析纯。
5.2.3 布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡见附录 A。

6 样品采集与处理
6.1 样品采集
按照 NY/T 541 的规定，采集待检猪、牛、羊血液样品 3~5 mL/份。
6.2 样品处理
血液样品用离心机 3000 r/min 离心 3 min，血清量不少于 500 μL。
6.3 样品购存
血清样品在 2℃~8℃ 可保存 24 h，如需长期保存应置 -20℃ 以下。

7 操作方法
7.1 准备
将布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡和待检血清样品回温至 25℃ 左右。
7.2 稀释
用样品稀释液将 50 μL 待检血清样品按 1:10 稀释。
7.3 加样
将布鲁氏杆菌病抗体荧光免疫层析法检测试剂卡水平放置，用移液器吸取已稀释好的待检样品 80 μL 垂直滴加于加样孔内。